<4D F736F F D F2EEE920E2E9F4F120E3E5F7E8E5F8E820E2E9F8F1E02E646F63>

תמליל

1 הדברת גורמי מחלות שוכני-קרקע באמצעות אמוניה Suppression of soil - borne pathogens by ammonia חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה מאת עמי גיפס הוגש לסנט האוניברסיטה העברית בירושלים כסלו תשס"ח דצמבר 2008

2 תודתי לכל האנשים שעזרו לי בעבודתי זאת בראש ובראשונה למדריכי דוקטור גיורא קריצמן, דוקטור פנחס פיין על הדרכתם המסורה ועזרתם הרבה במהלך ביצוע העבודה. לפרופסור דני שטיינברג על העצות המועילות במהלך העבודה לדוקטור יפת בן יפת ולמיכל לרבקה, שוש, לאריסה ובני על העזרה והתמיכה במהלך העבודה לדוקטור גוזל בן חיים ולדוקטור לאה צרור על העזרה בעבודה ולבני ביתי על הסבלנות וההבנה. ii

3 רשימת קיצורים וסמלים במ"ס בוצה מיוצבת בסיד ג' גרם ד' דקה טמפ' - טמפרטורה ל' ליטר מ' מולר מ"ג מיליגרם מ"ל מיליליטר מ"מ מילימטר ממ"ר מילימולר מ"צ מעלות צלזיוס מק"ג מיקרוגרם מק"ל מיקרוליטר מקמ"ר מיקרומולר ש' שעה CFU Colony Forming Units cm Centimeter CKD cement klin dust Ecosoil (alkaline stabilized biosolids) g Gram M Molar min - Minute ml Mililiter μg Microgram PDA potato dextrose agar PDAS - potato dextrose agar + streptomycine ppm Parts per million Rt Retention time F. o. f. sp. lycopersici - Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici S. rolfsii - Sclerotium rolfsii V. dahliae - Verticillium dahliae R. solani - Rhizoctonia solani iii

4 תוכן העניינים עמוד מבוא 2. סקירת ספרות 2.1 הדברת פתוגנים שוכני קרקע הדברה באמצעים אגרוטכניים עמידות גנטית הדברה פיזיקלית הדברה ביולוגית הדברה כימית הדברה באמצעות אמוניה 2.2 במ"ס-בוצה מיוצבת בסיד בוצות תהליך ייצור הבמ"ס ותכונות הבמ"ס אופי ההדברה ומנגנון הפעולה של במ"ס חומרים ושיטות 3.1 מצעי גידול 3.2 בדיקות כימיות 3.3 בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הפתוגנים והתפתחות המחלות בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת פתוגנים dianthi), Verticillium dahliae,f.oxysporum f.sp. (Sclerotinia sclerotiorum - ו Sclerotium rolfsii בתנאי מעבדה הדברת פוזריום בקרקע בית דגן הדברת פוזריום בשלוש קרקעות (חול סייני, סין חולי וחרסית) הדברת גופי קיימא של,Sclerotinia sclerotiorum Verticillium dahliae,sclerotium rolfsii ופרופגולים של פוזריום בקרקע בית דגן בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת פתוגנים dianthi),verticillium dahliae,f.oxysporum f.sp. ו solani ( Rhizoctonia בניסוי גידול תפו"א במכלים בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת F. oxysporum f.sp. dianthi בגידול ציפורן ניסוי ראשון 1999/ ניסוי שני 2000/ בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת Verticillium dahliae ו - solani Rhizoctonia בגידול תפו"א 3.4 בדיקת השפעת ריכוז האמוניה, תכונות הקרקע, תכולת הרטיבות iv

5 בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע בדיקת השפעת ריכוז אמוניה וסוג הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע, וריכוז האמוניה הגזית באווירת הקרקע בדיקת השפעת ריכוז אמוניה, סוג הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע 3.5 בדיקת השפעת ריכוזי האמוניה וזמני החשיפה על הישרדות הפתוגנים (in vitro) בדיקת השפעת ריכוז אמוניה וזמן חשיפה על הישרדות תפטיר של,Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Rhizoctonia solani,sclerotium rolfsii ו Verticillium dahliae בדיקת השפעת ריכוז אמוניה וזמן חשיפה על הישרדות גופי קיימא של Fusarium oxysporum f. sp.,sclerotium rolfsii Verticillium dahliae - ו lycopersici 3.6 בדיקת השפעת ריכוז האמוניה ותכונות הקרקע על שרידות תפטיר של Sclerotium rolfsii - ו Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici בקרקע 3.7 בחינת מנגנון הפעולה של אמוניה על Sclerotium rolfsii ו Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici בתנאי מעבדה בדיקת דליפה/הפרשה של אשלגן, חנקן אורגני וגלוקוז מתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו - rolfsii Sclerotium לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים בדיקת פעילות האנזים גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) בתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים בדיקת ריכוז ה - ATP בתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים בדיקת פעילות האנזים ATPase בממברנות תאי התפטיר של Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים בדיקת השפעת ph ומוליכות חשמלית במצע הגידול על התפתחות התפטיר של sp. Fusarium oxysporum f. Sclerotium rolfsii ו lycopersici 3.8 ניתוח סטטיסטי 4. תוצאות 4.1 השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הפתוגנים והתפתחות המחלות השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת פתוגנים,Verticillium dahliae,f.oxysporum f.sp. dianthi) (Sclerotinia sclerotiorum - ו Sclerotium rolfsii בתנאי מעבדה השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת פתוגנים dianthi) Verticillium dahliae,f.oxysporum f.sp. ו v

6 (Rhizoctonia solani בניסוי גידול תפו"א במכלים השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת F.oxysporum f.sp. dianthi בגידול ציפורן השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת Rhizoctonia solani,verticillium dahliae בגידול תפו"א 4.2 השפעת ריכוז האמוניה, תכונות הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע ועל קבלת אמוניה גזית באווירת הקרקע השפעת ריכוז אמוניה וסוג הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע, וריכוז האמוניה הגזית באווירת הקרקע השפעת ריכוז אמוניה, סוג הקרקע ותכולת הרטיבות בקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע, וריכוז האמוניה הגזית באווירת הקרקע השפעת ריכוז אמוניה, סוג הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע וריכוז האמוניה הגזית באווירת הקרקע 4.3 השפעת ריכוזי האמוניה וזמני החשיפה על הישרדות הפתוגנים (in vitro) השפעת ריכוז אמוניה וזמן חשיפה על הישרדות תפטיר של,Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Rhizoctonia solani,sclerotium rolfsii ו - dahliae Verticillium השפעת ריכוז אמוניה וזמן חשיפה על הישרדות גופי קיימא של Fusarium oxysporum f. sp.,sclerotium rolfsii Verticillium dahliae - ו lycopersici 4.4 השפעת ריכוז האמוניה ותכונות הקרקע על שרידות תפטיר של Sclerotium rolfsii - ו Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici בקרקע 4.5 בחינת מנגנון הפעולה של אמוניה על Sclerotium rolfsii ו - Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici בתנאי מעבדה דליפה/הפרשה של אשלגן, חנקן אורגני וגלוקוז מתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים פעילות האנזים גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) בתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים כימות ריכוז ה - ATP בתפטיר של f. Fusarium oxysporum sp. lycopersici ו - rolfsii Sclerotium לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים פעילות האנזים ATPase בממברנות תאי התפטיר של Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים השפעת ph ומוליכות חשמלית במצע על התפתחות התפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו Sclerotium rolfsii vi

7 השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הפתוגנים והתפתחות המחלות 5.2 השפעת ריכוז האמוניה, תכונות הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע ועל קבלת אמוניה גזית להדברה 5.3 השפעת ריכוזי האמוניה וזמני החשיפה על הישרדות הפתוגנים (in vitro) 5.4 השפעת ריכוז האמוניה ותכונות הקרקע על שרידות תפטיר של Sclerotium rolfsii - ו Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici בקרקע 5.5 בחינת מנגנון הפעולה של אמוניה על Sclerotium rolfsii ו Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici בתנאי מעבדה השפעת ריכוזי האמוניה על ה ph יציבות ממברנת הציטופלזמה פעילות האנזים גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) פעילות ATPase בפלסמלמה ובמיטוכונדריה של תאי התפטיר ותכולת ATP בתפטיר 5.6 מנגנון אפשרי לרעילות אמוניה 5.7 הערות סיכום לגבי הדברה באמצעות אמוניה 5. דיון סיכום 7. רשימת ספרות 8. תקציר באנגלית vii

8 ב ו 1. מבוא כיום עיקר ההדברה של גורמי מחלה שוכני - קרקע (כולל פטריות, חיידקים ונמטודות), הגורמים נזקים קשים בגידולים חקלאיים שונים, הוא על ידי חיטוי הקרקע בכימיקלים. הפסקת השימוש במתיל ברומיד, והגברת המודעות לנזק הסביבתי שגורם השימוש בכימיקלים, מביא לחיפוש חלופות הדברה ידידותיות יותר לסביבה. אמוניה ידועה כגורם ביוצידי. הפעילות הביוצידית של אמוניה כנגד מגוון רחב של פתוגנים מוזכרת במספר רב של עבודות et) Rush and Lyda, 1982; Chun and Lockwood, 1985; Jenkins Chang, 1999.(al., ;1998 Chang and רעילות האמוניה מיוחסת לדיפוזיה פסיבית של הצורה הלא מיוננת ) 3 (NH דרך הממברנות לתוך החלקים התוך תאים של האורגניזמים הרגישים (1985 Kleiner,.(Kleiner, ;1981 יצירת האמוניה בקרקע התבצע ע"י הוספת תוספים שונים לקרקע כמו: אוריאה 1999) Chang,,(Chun and Lockwood, 1985; Chang and אמוניה אל מימית 1982) Lyda, (Smiley et al., 1970; Rush and וזבלים אורגנים al.,) Lazarovits et.(2000; Lazarovits, 2001 בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) מורכבת משתי פסולות: בוצת שפכים שכמותה צפויה להגיע בשנת 2020 ל- 200,000 טון (משקל יבש) לשנה ופסולות אלקליות ביותר מתעשיית המלט. בעבודה זאת השתמשנו בבמ"ס חנקן אמוניקאלי ממקור אורגני ואנאורגאני כדי להעלות את ה- ph של תמיסת הקרקע, ולגרום ליצירת ריכוז ביוצידי של אמוניה בקרקע למשך זמן המספיק להדברת פתוגנים שוכני קרקע. עם זאת יש להימנע משינוי חריף מידי בתכונות הקרקע, העלול להפכה לפיטוטוקסית ואף לשנות את תכונותיה הכימיות והפיסיקליות באופן לא רצוי.לכן חשוב להתאים את כמות ואיכות התוספים לתכונות הקרקע ולפתוגן, על מנת לאפשר חזרה ספונטאנית של הקרקע לתכונותיה הקודמות בפרק זמן קצר. החזרה ל ph נורמלי בקרקע קשורה בעיקר לאספקה של CO 2 מפעילות מיקרוביאלית בקרקע ומהאטמוספירה. מטרות עבודה זו היו: 1. בדיקת יעילות ההדברה של הבמ"ס + אמוניה בתנאי מעבדה ובתנאי שדה. 2. קביעת ההשפעה של תכונות הקרקע על קבלת אמוניה גזית, והגדרת התחום האופטימלי של רטיבות הקרקע הדרושים לשם קבלת ריכוז אמוניה ביוצידי. 3. קביעת הריכוז ומשך החשיפה הדרושים לפעילות ביוצידית ע"י אמוניה. 4. קביעת מנגנון הפעולה של האמוניה על פתוגנים שוכני קרקע נבחרים. 1

9 2. סקירת ספרות 2.1 הדברת פתוגנים שוכני קרקע קיימות מספר שיטות להפחתת נזקי מחלות שוכנות קרקע: אמצעים אגרוטכניים, עמידות גנטית, הדברה פיזיקלית, הדברה ביולוגית והדברה כימית הדברה באמצעים אגרוטכניים הפעילויות האגרוטכניות כוללות בעיקר סדר גידולים, עיבוד הקרקע ומניעת הידוקה, הזנת הצמח, השקיה וממשק לחות בשטח, וכן בחירת מועד הזריעה ושיעורה, תכנון השדה או המטע תוך התחשבות בגידולים השכנים להם (פלטי וחובריו, 1998), ויצירת כנות עמידות (רוכב של צמח רגיש יחסית על גבי כנה של זני צמחים עמידים יותר למחלות) עמידות גנטית טיפוח צמחים עמידים למחלות ע"י שינוי תכונות מורפולוגיות או גנטיות בצמח היא אחת הדרכים החשובות בלוחמה בגורמי המחלות ובצמצום נזקיהן. דרך זו פשוטה למגדל ונקייה מזיהומי סביבה. אולם, היא מציבה קשיים בפני המטפחים, חברות הזרעים והשתלנים, בגלל יכולתם של מחוללי המחלות לשבור את העמידות לאחר זמן מסוים הדברה פיזיקלית מדובר על שלוש שיטות עיקריות: יבוש הקרקע למשל בעזרת חריש עמוק, חיטוי בקיטור וחיטוי סולרי. חיטוי בקיטור מבוסס על חימום הקרקע בקיטור למשך מספר שעות (2000.(Runia, שיטה זו מקובלת בעיקר בחממות שבהן קיימים מתקנים מתאימים ליצירת הקיטור והחדרתו לקרקע, אך הביצוע מסובך ויקר יחסית. החיטוי יעיל בהדברת פגעים אך הוא כללי והבררנות שלו מועטה, ולכן קיימת סכנה של פגיעה גם במיקרואורגניזם מועילים. בעיה נוספת היא אפשרות של שחרור מנגן ברמות רעילות לצמחים שגדלים בקרקע מחוטאת (קטן, 1998). חיטוי באנרגיית השמש (סולרי) על ידי חיפוי בפוליאתילן שקוף המאפשר חדירה של הקרינה אל פני הקרקע אך מונע או מפחית את הקרינה החוזרת. משך החיפוי הדרוש להשגת חיטוי הקרקע הוא לפחות חודש אחד בקיץ (יוני-אוגוסט) שבמהלכו הטמפרטורה של שכבת הקרקע העליונה עולה עד מ"צ (קטן וחובריו, 1987). במהלך החיטוי הסולרי מתרחשים בקרקע שינויים פיזיקליים, כימיים וביולוגיים, שגורמים לקטילה יעילה של פגעים (1991,(Davis, או החלשתם (1983 al.,.(lifshitz et שיפור תנאי הגידול ודיכוי התבססות מחודשת של הפגעים בקרקע (1991 DeVay,.(Katan and חיטוי סולרי נמצא יעיל כנגד טווח רחב של פגעים, ביניהם 2

10 פטריות, חיידקים, נמטודות ועשבים DeVay,) Porter and Merriman, 1983; Stapleton and Katan, 1987.(1983; Rubin and Benjamin, 1984; פטריות פתוגניות מגלות רגישות שונה לחום. הרגישות ביותר הן הורטיציליום והדמטופורה והעמידות הן המגלת וקישיון רולפסי (קטן, 1998). חיטוי סולרי עשוי לגרום ל response,(igr) Increased growth בעקבות שיפור מבנה הקרקע, הגדלת זמינותם של גורמי הזנה ועידוד התבססות מיקרואורגניזמים חיובים להתפתחות הצמח 1986) Sorensen,.(Chen and Katan, 1980; Davis and יתרונות השיטה הן בפשטות ביצועה ובעובדה שהיא אינה כרוכה בשימוש בחומרים כימיים מסוכנים. מגבלותיה העיקריות הן תלותה באקלים והצורך להשבית את החלקה במשך מספר שבועות. להגברת האפקטיביות של השיטה ניתן לשלבה עם שיטות נוספות כמו שילוב עם זבל עופות להדברת קשיון רולפסי, ועם שמנים אתרים שונים להדברת מיני פוזריום (לוסטיג, 1995) הדברה ביולוגית הדברה ביולוגית מושגת בתנאים בהם הפעילות וכושר המחייה של פתוגן פוחתים כתוצאה מפעילות של מיקרואורגניזם אחר, דבר המביא להפחתת חומרת המחלה הנגרמת ע"י אותו פתוגן (1974 cook,.(baker and הצלחת ההדברה הביולוגית תלוייה בכשרו של אנטגוניסט להפחית את כמות יחידות הקיימא של הפתוגן (1980 Lumsden,.(Papavizas and השינויים בהרכב אוכלוסיות המיקרואורגניזם בקרקע, ניתנים ליישום ע"י תוספות שונות לקרקע או ע"י ישום ישיר של האנטגוניסטים לקרקע. יחסי אנטגוניזם בין מיקרואורגניזם בקרקע מתבטאים במס' אופנים: תחרות, טפילות, אנטיביוזיס, השראת עמידות ושינוי בדפוסי פתוגניות.(Elad,1996) למשל, מיני Trichoderma ידועים כאנטגוניסטים יעילים נגד פטריות מחוללות מחלות בקרקע (ריזוקטוניה וקישיון רולפסי) ע"י הפרשת חומרים מעכבים (1993 Stapleton, (Gamliel and ועל ידי מיקופרזיטיזם ותחרות (אלעד, 1998). המדביר (Pseudomonas fluorescens) Hv37a מפחית בכותנה חולי נופל הנגרם ע"י Pythium ultimum באמצעות מנגנון הדברה הקשור בפעילות אנטיביוטית al.,1987) (2003) Steyaert et al..(howie et מצאו כי מיקופרזיטיות ע"י מיני טריכודרמה שונים הנה בעיקר ע"י יצירת אנזימים המפרקים את דופן התא של הפתוגן. הדברה ביולוגית של מחוללי מחלה בקרקע היינה בעייתית מאוד בגלל צורך באורגניזמים בעלי פעילות אמינה ומשמעותית עם כושר הישרדות בסביבה הטבעית, פעילות במגוון של תנאי גידול אפשריים בקרקע כנגד טווח רחב של גורמי מחלה, וחיי מדף ארוכים. רקמות צמחיות במצבים שונים (חיות, מתות או מתפרקות), מהוות מרכיב פיזיקלי, כימי וביולוגי חשוב בקרקע (1975 Gilbert,.(Lindeman and שיירי צמחים, כמו גם חומרים אורגניים אחרים בקרקע כגון: זבל בע"ח, קומפוסט וכיו"ב, עשויים לגרום לשינוי בתנאי הסביבה (תאחיזת מים, טמפ', ph ואיוורור) ולהשפעות נרחבות על האוכלוסיה המיקרוביאלית בקרקע; הפעילות המיקרוביאלית מוגברת, ישנה תחרות על מקורות מזון וחמצן ותנאים אלו עשויים להיות 3

11 אנטגוניסטים לפגעים (1974 Cook,.(Baker and בתוספים אורגניים מתייחסים בעיקר לקומפוסטים מפסולת גננית, יערנית, עירונית או תעשייתית. הצלחות של שימוש בקומפוסטים, דווחו, בין היתר, בהפחתת נזקי מחלות הנגרמות על ידי מינים שונים של פיתיום וריזוקטוניה סולני,(Ben-Yepher and Nelson, 1999; Pascual et al., 2000; Scheuerell et al., 2005) הפחתת נזקי נמטודות באמצעות קומפוסט אשפה עירונית (1986 Fahy,,(Hoitink and שימוש בקומפוסט בוצת שפכים הפחית נגיעות של Fusarium wilt במלפפונים וריקבון הכתר בפלפל הנגרם ע"י.(Lumsden et al., 1983) Phytophthora אחד המנגנונים העיקריים של פעילות ההדברה המתקבלת ע"י קומפוסטים הוא הוספה לקרקע של מיקרואורגניזמים (חיידקים ופטריות) אנטגוניסטיים המתרבים בקומפוסט בזמן הבשלתו Suarez-Estrella) Craft and Nelson, 1996; Pascual et al., 2002; ;הדר וכהן, 1996 al., 2007.(et התבטאותם של המיקרואורגניזם האנטגוניסטיים בהדברת המחלה תלויה במידה רבה, בהשפעה של הקומפוסט על מאזן הפחמן הזמין בקרקע ובכך על הזנת הפתוגנים ועל המאזן בין קבוצות המיקרואורגניזמים בקרקע 1990) Hadar, Bulluck et.(mandelbaum and al. (2002) מצאו שאוכלוסיית המיקרואורגניזם המועילים עלתה במקביל לירידה באוכלוסיות הפתוגנים כתוצאה מהוספת תוספים אורגניים (קומפוסט זבל בקר, קומפוסט פסולת מנפטות כותנה וקומפוסט מאשפה), כאשר השפעה זו יוחסה לעלייה בריכוז מיקרואלמנטים כגון מגנזיום, אשלגן, מנגן וסידן, הגדלה בכמות החומר האורגני, כלל הפחמן ושיפור תכונות הקרקע. אנטיביוזיס וטפילות הם מנגנונים נוספים. לדוגמה, מצע קומפוסט מזבל בקר גרם לליזיס מהיר של תפטיר פטריית הפיתיום ואפשר היה לקיים מספר מחזורי צמיחה של מלפפון (הדר וכהן, 1996). בנושא זה ישנם דיווחים אופטימיים רבים בספרות (הדר וכהן, 1996), ואכן נצפתה הטבה בעמידות לגורמי מחלה שוכני-קרקע לאחר יישום קומפוסטים. עדיין, הרושם הכללי הוא כי טווח הפעילות של קומפוסטים אורגניים בהדברת מחלות הוא מצומצם וכי יעילות ההדברה אינה גבוהה, ובעיקר אינה הדירה. אחת הסיבות העיקריות לאי האחידות בממצאים היא כנראה המגוון הגדול של קומפוסטים המצויים בשוק ובקושי האובייקטיבי למדוד את תכונותיהם הרלוונטיות (הן כתוסף לקרקע והן לצורך הדברה). אמנם משווק היום מצע מנותק המבוסס על קומפוסט ואשר מבטיח דיכוי קבוע של פתוגנים (1990.(Hoitink, לעומת זאת, מרבית הקומפוסטים בעיקר כאלה שאינם בשלים, עלולים אף להגביר נגיעות במחלות קרקע. שילוב של תכונות הקומפוסט (קביעות של מקור חומר הגלם, תנאי ומשך תהליך הקומפוסטציה ובשלותו) יחד עם גורמי סביבה (טמפרטורת המצע, תכולת הרטיבות במצע, הרכב מי ההשקיה, ועוד) הם תנאי הכרחי להצלחת הדברה ביולוגית ביישום הקומפוסט בשדה או בחממה. האפשרות להבטיח כל אלה קשה בד"כ, בעיקר בשדה, וזה כנראה אחד מגורמי הכישלון העיקריים של קומפוסטים אורגניים בהדברה ביולוגית. 4

12 הוצעו מס' מנגנונים כימים להשפעה של קומפוסטים ותוספים אורגניים כמו קמח בשר ועצמות, שאריות צמחים ועוד על גורמי מחלה בקרקע. א) נוכחות אמוניה בקרקע כתוצאה מאמוניפיקציה של חנקן אורגני שהוסף ) al.,2002; Howel et al., 1988; Candole et al., 1997; Huang et Tenuta and Lazarovits, 2002; Zhou and Everts,2004; Conn et al., 2005; Abbasi et.(al., 2005 ב) ירידת ph תמיסת הקרקע כתוצאה מתהליך הניטריפיקציה לערך הנמוך מ 5.5 מביאה ליצירת חומצה חנקנית ) 2,(HNO תרכובת רעילה לפתוגנים רבים וכן לזרעים של עשבים ושל גידולים שונים ) Mew, Tsao and Oster, 1981; Loffer et al., 1986; Michel and 1998; Tenuta and Lazarovits, 1999; Tenuta and Lazarovits, 2002: Conn et al., 2005). ג) אתילן שנוצר ע"י צמחים וכן כתוצאה מפעילות מיקרוביאלית בתנאים אארוביים או אנאירוביים 1975) Gilbert,.(Smith, 1973; Linderman and פונגיסטזיס ב rolfsii S. מושפע מאיזון שבין הנוטריאנטים בקרקע שמהווים סימולטורים, לבין האתילן שמהווה גורם מדכא (1973.(Smith, ד) חומרים נדיפים כמו: אצטאלדהידים, שהגבירו אוכלוסיות של פטריות בקרקע ומתאנול, שהגביר אוכלוסיות של חיידקים. שילובם הגביר באופן סינרגיסטי בקטריות ואקטינומיציטים. אתאנול ואצטאלדהיד גרמו להגברה זמנית בנשימת מיקרואורגניזמים ולניצול תרכובות אלו, ללא שינוי בגודל האוכלוסייה (1972 Owens,.(Griebel and וכן חומרים נדיפים אחרים העשויים להשפיע כביוציד בריכוזים ובתנאי סביבה מתאימים ) ;2000 Smolinska, al., 2005 (Lazarovits, 2001; Smolinska et al., 2003; Conn et ה. ( שינוי ph תמיסת הקרקע 2007) al.,.(abbasi et al., 2005; Niwa et הדברה כימית גישה המבוססת על החדרת תכשירי הדברה רעילים לקרקע. יישומם מגוון וכולל החדרה לקרקע כגז, נוזל, מוצק, או כתכשירים לציפוי זרעים. הנפוץ ביותר היה השימוש במתיל ברומיד 1994) al.,.(vigodsky and Klein, 1976; Ben-Yephet et היתרון המרכזי של המתיל ברומיד הוא טווח פעולה הרחב שלו כנגד פתוגנים רבים (כולל חיידקים, פטריות, וגם נמטודות ועשבים רעים). החסרון המרכזי של המתיל ברומיד הוא בעובדה שהוא פוגע בשכבת האוזון, לכן הוחלט בועידת מונטריאול 1991 להוציאו מן השימוש בהדרגה עד לשנת 2005 במדינות המפותחות ועד לשנת 2015 במדינות המתפתחות ולמצוא לו תחליפים הולמים. התחליפים למתיל ברומיד יעילים פחות ובעיקר נפוץ השמוש במתם-סודיום ("אדיגן") המשמש בעיקר להדברת נמטודות ופטריות (1985 Frank,,(Ben-Yephet and מתם-סודיום מיועד לקטילת פטריות קרקע, נמטודות חופשיות ומזיקי קרקע שונים. החומר הפעיל הוא sodium Krikum ) הניתן בתמיסה מימית המוחדרת לקרקע עם מי ההשקיה methyldithiocarbamate Frank, 1982.(and פורמלין (פורדור 37) משמש בעיקר להדברת חיידקים, נמטודות חופשיות ופטריות ירודות (1992 al.,.(kritzman et פורמלין הינו תכשיר נוזלי המכיל 37% פורמאלדהיד 5

13 המומס במים בתוספת מתנול כחומר מייצב. הוא מומלץ להדברת סטרפטומיצטים באגוזי אדמה ותפוחי אדמה ולהדברה של פטריות קרקע פתוגניות לעגבניות (קטן, 1998). ביישום בשטח גלוי, מחדירים לקרקע לעומק הרצוי, באמצעות מערכות השקיה למינן. בזאמיד הינו תכשיר גרגרי, המתפרק לחומר הפעיל של תכשירי מתאם-סודיום. מומלץ להדברת מחלות קרקע שמחולליהן פטריות, מפוזר ומוצנע לקרקע לפני השתילה או הזריעה. קונדור הינו תוארית מיוחדת של טלון II (נוזל, המכיל 94% דיכלורופרופן) המיועדת ליישום דרך מערכת הטפטוף תחת כיסוי יריעות פלסטיק, מומלץ להדברת נמטודות עפצים וחופשיות. חומרים אלה, וחומרים כימיים שונים נוספים כמו: מתיל יודיד, פרופרגיל ברומיד וקומבינציות רבות של דיכלורו פרופאן וכלורופיקרין לא מכסים את כל הטווח של המזיקים כפי שעשה זאת מתיל ברומיד לבדו ולכן לרוב משתמשים בצירוף של מספר חומרים לשיפור האפקטיביות והרחבת תחום פעילותם USDA) אינטרנט;.(Katan, 1999 השימוש בהדברה כימית להתמודדות עם מחוללי מחלות שוכנות קרקע בעייתי ממספר סיבות: קשה להגיע לפתוגן בקרקע (חסמים פיסיים בקרקע, טיפול בכמות גדולה של קרקע), חלק מיחידות הריבוי וההשתמרות של הפתוגנים נמצאות בתוך שיירי הצמח החולה (משפיע על גורלו של חומר ההדברה בקרקע), חומרי הדברה לא מחזיקים מעמד בקרקע לאורך זמן, פגיעה במיקרואורגניזם מועילים בקרקע תוך כדי מהלך ההדברה. בגלל כל אלה ועקב הצורך בהפחתת השימוש בחומרי הדברה כימיים, יש צורך למצוא חלופות יעילות לחומרים הכימיים. לכן נערך בשנים האחרונות מחקר ופיתוח שמטרתו לפתח אמצעיים פיזיקליים או שימוש בתכשירים ביולוגים הדברה באמצעות אמוניה תהליך יצירת האמוניה בקרקע הנו חלק מתהליך המינרליזציה, שניתן לתארו באופן כללי כלהלן: - - NO.Organic N NH + 4 השלב הראשון בתהליך הוא האמוניפיקציה 2 NO 3,(ammonification) ואחראים לו סוגים רבים ושונים של מיקרואורגניזמים. השלב הבא בתהליך הוא חימצון האמוניום (ניטריפיקציה,,(nitrification המתרחש בקרקעות מאווררות על ידי חיידקים אוטוטרופים ספציפיים (ניטרוזומונס וניטרובקטר) (להב וחוב', 1999). לפיכך, הצורה המינרלית העיקרית של חנקן בקרקעות מאווררות היא החנקה ) 3 - (NO וכשהאוורור בקרקע לקוי, יצטברו אמוניום ) 4 וניטריט ) 2 + (NH.(NO - אמוניה ידועה כגורם ביוצידי. היעילות הביוצידית של האמוניה תלויה בריכוז שלה בתמיסת הקרקע ובאווירת הקרקע. ריכוז האמוניה תלוי בריכוז הכללי של האמוניום ) 4 + (NH בקרקע, בריכוז האמוניום בפאזה המימית בקרקע, ובשיווי המשקל בין האמוניום לאמוניה בתמיסת הקרקע אשר תלוי בעיקר ב- ph של תמיסת הקרקע. לפי משוואת הנדרסון - הסלבלך: ph.log {NH 3(g) ]/[NH 4 (aq) ]} = לדוגמה, ב ph ריכוז אמוניה בתמיסה יהיה פי 10 מריכוז האמוניום. גורמים אחרים המשפיעים על ריכוז האמון הגזי הם ספיחת האמוניום 6

14 בקרקע, ריכוז החרסית בקרקע וסוג החרסית, קיבול הקטיונים החליפים של הקרקע, וכושר הבופר של הקרקע במערכת הביקרבונט ) and Martens and Bremner, 1989; Whitehead (Raistrick, 1993 (לפי: 7.81 ph.(log {CO 2 ]/[HCO - 3 ]} = קצב המעבר של האמון לפאזה הגאזית תלוי בלחץ החלקי של (לפי חוק הנרי: ) 3 ). NH 3 (aq)] = KH P(NH יש לציין, כי כשריכוזי האמוניה הגזית בקרקע גבוהים יחסית (בריכוזי אמון כללי ו- ph גבוהים) חל עיכוב של תהליך הניטריפיקציה. העיכוב חולף לאחר נידוף של האמוניה. הפעילות הביוצידית של אמוניה כנגד מגוון רחב של פתוגנים מוזכרת במספר רב של עבודות Rush and Lyda, 1982; Chun and Lockwood, 1985; Jenkins et al., 1998;) Gowda, 2004.(Chang and Chang,1999; יצירת האמוניה בקרקע התבצעה ע"י הוספת תוספים שונים לקרקע כמו: אוריאה ) and Chun and Lockwood, 1985; Chang Smiley et al,.1970; Smiley et ) אמוניה אל מימית,(Chang,1999; Green et al., 2006 Lyda, 1982 (al,.1972; Rush and שאריות צמחים, זבלים אורגנים, ותוספים אורגניים עתירי חלבון ) Lazarovits, Gilpatrick, 1969; Shiau et al., 1999; Lazarovits et al., 2000; al., 2005.(2001; Lazarovits et al., 2001; Bardin et al., 2004; Conn et רעילות האמוניה מיוחסת ליכולת הדיפוזיה של הצורה הלא מיוננת (NH3) דרך הממברנות לתוך החלקים התוך תאים של האורגניזמים הרגישים Kleiner,1985).(Kleiner et al.,1981; מנגנון ההדברה של מיקרואורגניזם ע"י האמוניה עדיין אינו ברור דיו, ויש לגביו מספר השערות: {1} עיכוב של מערכת העברת האלקטרונים, במיוחד ע"י עיכוב של חמצון NADH Vines and Wedding, (1960); {2} יצירת תנאי ph לא מיטביים להתפתחות הפתוגן בעת יישום האמוניה ) and Henis ;(Chet, 1967 {3} הפרעה בתפקוד ממברנות הפתוגן 1982) Lyda, ;(Rush and {4} עיכוב יצירת AMP מחזורי (1979 Sussman, ;(Schindler and {5} אמוניום מעכב מיוזיס וסינטזת (pre-meiotic) DNA ב cerevisiae,saccharomyces אינקובציה ממושכת של התאים עם אמוניום גורמת לפירוק מסיבי של,(Pinon, (1977 DNA כמו כן אמוניום מעכב סינטיזה של חלבון ופירוק חלבון בפטרייה זו בזמן יצירת.(Croes et al., (1978 ascus במערכות אנימליות צוינו מספר מנגנונים נוספים לגבי רעילות אמוניה: מפריעה למפל האלקטרוכימי בתא וגורמת להחמצה של הציטופלזמה, האנרגיה לשמירת הומיאוסטזיס בתא ושינוי פעילויות של אנזימים כמו {1} הצטברות אמוניה דבר המגביר את צריכת phosphofrutokinase כתוצאה מהחמצה של הציטופלזמה (2000 al.,.(cruz et {2} כניסה לא מבוקרת של יוני 2+ Ca לציטופלזמה מהחללים החוץ-תאיים ע"י הפעלה של רצפטורים של גלוטמאט מסוג N ) NMDA.(Methyl-D-aspartate {3} רובו של סידן זה שנכנס לתא עובר למיטוכונדריה מונע ע"י פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה ויתחרה עם ATP סינטאז המיטוכונדרי עבור פרוטונים ) Kosenko.(et al., 2000 הפעלה מוגברת של קולטני רדיקלים של סופראוקסיד ולפעילות יורדת NMDA בתרבית של תאי עצב הובילה ליצירת של אנזימים נוגדי חמצון במוח כמו: Superoxide 7

15 Kosenko et ) בציטוסול ובמיטוכונדריה ופעילות קטלז בציטוסול ובבמיטוכונדריה dismutase.(al., 1999 {4} הרעלה חריפה של אמוניה מעלה את חמצון הליפידים והרס ממברנות כפי שנקבע באמצעות מדידה של.(Kosenko et al., 1999) (malondialdehyde) MDA {5} פחיתה ברמת ה- glutathione וירידה של יחס GSH/GSSG בתאי מוח חולדה ) et Kosenko.(al., 1999 סקירה של העבודות שנעשו מצביעה שאין תמימות דעים לגבי ריכוז האמוניה ומשך החשיפה הדרוש להדברה מוצלחת של פתוגנים שונים. תחום הריכוזים של האמוניה שנמצאו יעילים בהדברת פתוגנים שונים נע מרמות של 1900 מ"ג אמוניה/ק"ג קרקע לאחר 4 ימי חשיפה וכ- 500 מ"ג אמוניה/ק"ג קרקע לאחר כ- 30 ימי חשיפה כאשר הפתוגנים היו Pythium ultimum או,(Chun and Lockwood, 1985) Thielaviopsis basicola מעל ל מ"ג אמוניה/לליטר אוויר כאשר הפתוגן היה,(Chang and Chang,1999) Phellinus noxius 1100 מ"ג אמוניה לק"ג קרקע כאשר הפתוגן היה (Sequeira, (1963.F oxysporum.f sp. cubense ועד רמות של 4 ו 6 מ"ג אמוניה לליטר תמיסה, לגבי Phytophthora cinnamomi ו Phytophthora parasitica בהתאמה 1981) Oster, (Tsao and ו - mm 20 אמוניה במצע PDA כאשר הפתוגנים היו Penicillium griseofulvum ו graminearum Depasquale and ) Fusarium.(Montville, 1990 הדברה באמצעות אמוניה בשדה נתקלת במספר בעיות: {1} יש צורך בשימוש בכמות גדולה של חנקן אנאורגני כאשר משתמשים בדשן כמו אוריאה לקבלת ריכוז האמוניה הרצוי בקרקע וככל ש - ph הקרקע נמוך יותר, כך נדרשת כמות גדולה יותר של הדשן. {2} פיזור החנקן האנאורגני בקרקע אינו אחיד כאשר מדובר על יישום של אמוניה אל מימית בקרקע וכתוצאה מכך נשארים אזורים לא מטופלים. {3} ביישום של תוספים אורגנים ואנאורגניים יש תלות ישירה בין ריכוז האמוניה שמתקבל בקרקע לבין ph הקרקע. במ"ס בוצה מיוצבת סיד בוצות בוצות שפכים המופקות במכוני טיהור שפכים בארץ יכולות להיות שונות מאד בהרכבן הכימי, באיכותן החקלאית ובהשפעתן האפשרית על הסביבה. סוג תהליך הטיפול משפיע על הבוצה. בוצות "ראשוניות" מתקבלות משיקוע של המוצקים שביוב הגולמי. בוצות "שניוניות", הן תוצר של הטיפול הביולוגי במי השפכים, והן רובן ככולן המאסה המיקרוביאלית שנוצרת בתהליך עצמו (ארביב ובלנק, 1997). בוצה ראשונית נוצרת במתקני טיפול הכוללים אגני שיקוע ראשוניים. הבוצה הראשונית הינה חלק ממסת המוצקים המרחפים, הנמצאים בשפכים וניתנת לשיקוע באגן שיקוע במשך מספר שעות שהייה. ריכוז המוצקים, היוצאים משיקוע ראשוני, הינו בדרך כלל כ 8

16 .2% עד 1 הבוצה הביולוגית (השניונית) מאפשרת את קיום התהליך הביולוגי המבוסס על התפתחות כמות גדולה של חיידקים, הניזונים מהחומר האורגני שבשפכים ומפרקים אותו תוך כדי הגדלת ריכוזם וכמותם. ריכוז המוצקים בבוצה השניונית הוא לרוב 0.5 עד 1% (מסינג, 1997). תהליכי עיכול וייצוב של בוצות גורמים להבדל גדול בין בוצות בלתי-מיוצבות לבוצות מיוצבות, ובין בוצות מייצוב אווירני (עם חמצן) לבוצות מייצוב אל-אווירני. בוצות ללא ייצוב או לאחר ייצוב אווירני חלקי עשירות יחסית בחומר אורגני בר פירוק וביסודות הזנה נוזליות יותר. חקלאי. הזבובים יצוב אל (פיין, (חנקן וזרחן), והן נוטות להיות בוצות אלה מסריחות מאוד והן מוקד להתרבות זבובים ואינן מורשות לשימוש אווירני של בוצות מפחית מאוד.(2000 באופן כללי, ריחות ככל שהבוצה מיוצבת פחות, יותר אולם גם גדלה הבעייתיות הכרוכה ביישומה בקרקע. רעים ומקטין מאוד את משיכתם של ערכה כמקור יסודות הזנה רב המצב הרגיש ביותר לזיהום הוא ביישום בוצות שפכים בלתי מיוצבות בקרקעות קלות ו/או רדודות מעל אקוויפר פעיל. גורמי הסיכון העיקריים הם: דליפה לא מבוקרת של חנקות וחומר אורגני מומס והצטברות עודפי זרחן בקרקע (פיין ודן, 1997). אי-הקפדה של מספר יצרנים על איכות הבוצה ועל יישום טיפול קרקעי מתאים לבוצה בגלל חוסר ידע ו/או רצון מסוימים. כמו כן, להקטנת גרם עלויות, זה היה אחד הגורמים למפגעי ריח וזבובים ולהתנגדות ליישום בוצה באזורים להחמרה בתקנות ליישום בוצה ולדרישה הגורפת לשימוש חקלאי בבוצות "סוג א" בלבד. בוצה סוג א' היא מוצר מיוצב, מופחת חומר אורגני ויסודות הזנה, וכמעט נטול פתוגנים וטפילים. התהליכים המקובלים לקבלת בוצה סוג א' ייבוש, הם: קומפוסטציה ביולוגית, כיפתות בחום ולחץ מתאימים, וייצוב עם סיד (פיין, 2000). לקומפוסטציה הביולוגית מספר יתרונות: ריח, והוא ניתן לאחסון הכוללת עלות גזם עץ (בטון), איסוף וטיפול נוזלים, שאיבה של אויר מתחת לערמה), להרטבה, ומשך הכנה ארוך התוצר נקי מבחינה סניטרית, לזמן ממושך יחסית. (הדרוש לייצור הקומפוסט), איסוף ונטרול גזים, (פיין, חסרונות התהליך יציב יחסית לפירוק נוסף, הם: ליצרן ללא מפגעי עלות ייצור גבוהה, מתקני ייצור סגורים הכוללים משטחי ייצור אוורור מאולץ לערמות הקומפוסט צורך במכשיר מכאני כבד להיפוך הקומפוסט,.(2000 (דחיסה או צריכת מים זמינות יסודות ההזנה מהקומפוסט תלויה בהרכב חומרי המוצא, והיא עולה עם ירידה ביעילות התהליך. כתוסף לקרקע, קומפוסט בשל הוא מקור איטי-שחרור ליסודות הזנה ובעיקר לחנקן זמין. כופתיות מבוצה הן מוצר ידידותי מאד למשתמש. מהיותו בוצה דחוסה ומיובשת,.(Evans, 1998) האפקט שלהן על הגידול דומה כנראה לזה של הבוצה עצמה היתרון הגדול על בוצה גולמית (ראשונית או שניונית) הוא בנוחות האחסון והפיזור. לא ברור מה תהיינה התכונות של כופתיות מבוצה שאינה מיוצבת לחלוטין, בעיקר בתנאי אחסון. העלות הגבוהה של תהליך הייצור (בגלל תכולת המים הגבוהה של הבוצה), מחד גיסא, והעובדה כי ניתן לקבל החזר כספי כלשהו משריפת הכופתיות, מאידך גיסא, עלולות לגרום לכך שהמוצר יגיע למשרפות במקום לתרום לפוריות הקרקע ולהחליף דשן (פיין, 2000). 9

17 2.2.2 תהליך ייצור הבמ"ס ותכונותי הבמ"ס כבוי הבמ"ס נוצרת כאשר מוגבת בוצה שעברה תהליך של הוצאת מים (dewatering) בשיטות סינון לחץ press) (belt או בואקום פילטר ("סינון עוגה") יחד עם תוספים אלקליים המכילים אל-מימת הסידן CaO) (Calcium oxide - ו/או מימת הסידן ) 2 Ca(OH).(lime, calcium hydroxide - מקורות מקובלים לחומרים אלה בארץ הם: אבק כבשני מלט (Cement Kiln Dust) CKD ואפר מרחף של פצלי שמן (אפ"ש). בעולם משתמשים גם באבק כבשני גיר,(LKD) סיד חי (CaO) או (Ca(OH) 2 ) ואפר פחם מרחף Logan and Burnham, 1995; Chambers and ).(Nicholson, 1998 בתהליך ייצור הבמ"ס, CaO מגיב עם המים בבוצה Heat) (CaO + H 2 O Ca(OH) OH (Ca(OH) Ca 2+ + ומתקבל חומר בעל ה - 2 Ca(OH) שנוצר עובר דיסוציאציה ) בתחום של במהלך ההגבה של התוספים האלקאליים עם הבוצה, CO 2 שמקורו מפירוק הבוצה ומהאטמוספרה מגיב עם מים ליצירת חומצה פחמתית, שמגיבה עם הריכוזים הגבוהים של סידן מסיס בתערובת, ליצירת קלציט. ph CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 H 2 CO 3 2H + + CO 3 2- Ca 2+ + CO 3 2- CaCO 3 כמות וסוג התוספים האלקאליים וכן שיעור הקרבוניזציה במהלך תהליך יצירת הבמ"ס יקבעו כמה מהאלקליניות השאריתית alkalinity) (residual בבמ"ס תהיה בצורת Ca(OH) 2 או כ.CaCO 3 היחס בין מרכיבים אלה ישפיע על ה ph של הבמ"ס. ה ph של Ca(OH) 2 במים הוא סביב 12.5 לעומת זה של ה - 3 CaCO שהוא בקירוב ( (Logan, במהלך הייצור חל פיסטור מלא של אוכלוסיות הפתוגנים בבוצה עקב השילוב של ph בסיסי מאוד (>12), טמפרטורה גבוהה (>55 מ"צ), ריכוז גבוה של אמוניה (כתלות בתכולת הבוצה) וייבוש מואץ, עם זאת בבמ"ס נותרים די מיקרואורגניזמים המעורבים בתהליכי פירוקו ) לגרם) התורמים לייצובו בקרקע 1995) Burnham,.(Logan and הבמ"ס מאופיין בתכונות הפיסיקליות הבאות: תכולת מוצקים ממוצעת - 62%, צפיפות חלקיקים ג'/סמ"ק, משקל נפחי ג'/סמ"ק, פורוזיביות גבוהה (70% מהנפח) עם גודל גרגר ממוצע כ - 2 מ"מ, תאחיזת מים,66 34,58 ו 31 אחוז (V/V) ברוויה, 33 KPa,5.9 KPa ו MPa 1.5 בהתאמה. תכולת מים זמינים 27% לנפח, ומוליכות הידראולית גבוהה 10*3 2-.(Logan and Harrison, 1995) cm/sec תכולת הפחמן בבמ"ס היא כ,12% המביא להערכה של כ 20% חומר אורגני (בערך כחצי מהכמות בבוצה מעוכלת, שההבדל הוא כתוצאה מהוספת התוספים האלקליים. תוספים אלה קובעים את כמות החומר האורגני ורמתם עולה ככל שתכולת החומרים המוצקים בבוצה הממוצקת יורדת (1992.(Logan, הבמ"ס מכיל כ 1% חנקן כללי ) 3,(50 mg/kg N-NO 3,200 mg/kg N-NH מרבית החנקן בבמ"ס יופיע כחנקן אורגני. 10

18 בדיקות אינקובציה במעבדה הראו שכ 15 עד 20% מהחנקן עוברים מינרליזציה במשך 60 יום. שיעור המינרליזציה בפועל הוא כ 30% מהחנקן בבוצה בדומה למה שהתקבל בבוצה מעוכלת. בגלל ה ph הגבוה של הבמ"ס יש נידוף של אמוניה מהבוצה, אם זאת יש לציין שכ 50% מהחנקן בצורת אמוניה שהשתחרר נספח בחוזקה לתוספים האלקליים, יתכן באמצעות יצירת.(Logan et al.,1993) (NH 4 ) 2 CO 3 זרחן כללי בבמ"ס משתנה בין % עם ממוצע של 0.4%, רמה זו נמוכה בהרבה מרמת הזרחן בבוצה מעוכלת שהיא לרוב בסביבות 1-3%, כל הזרחן נתרם ע"י הבוצה וקיים בבמ"ס כצירוף של זרחן אורגני וסידן זרחתי. ריכוזי אשלגן, סידן ומגנזיום ממוצעים בבמ"ס (אחוז למשקל) הם: 1%, 20% ו - 1% בהתאמה (1992.(Logan, החומר נקי מפאתוגנים אך נותרה בו כמות גדולה של מיקרואורגניזם מפרקים, התורמים ליציבותו בקרקע. זמן קצר לאחר הערבוב בקרקע (ימים עד שבועות ספורים), יורד ה - ph של תמיסת הקרקע ל - 9 או פחות. למרות התגובה הבסיסית, לחומר עצמו ולתערובותיו בקרקע, יש זמינות גבוהה של חנקן, זרחן ומיקרואלמנטים. לבמ"ס יש יתרונות ניכרים מבחינת יצרן הבוצה, הכוללים משך הכנה קצר מאד (דקות עד שעות) ואפשרות להשתמש בכל סוג בוצה, ובטווח רחב של תכולות מים (18% עד 40%). האפשרות, לכאורה, לדלג על שלב הייצוב ולחסוך בכך כסף רב, המושקע במתקנים ובתהליך עצמו, יכולה לגרום להעדפה של התהליך ע"י גורמי התכנון. הבמ"ס הינה תחליף יעיל לקומפוסט המיושם בלאו הכי בקרקע בגידולים רבים (פיין וחובריו, 2004). בנוסף לכך, הבמ"ס נקי מגורמי מחלה ומזרעים של עשבים רעים. החסרון העיקרי של הבמ"ס הוא בכך שמרכיב הבוצה הנו כ- 10 עד 20% מהמוצר ויתר החומר הוא סיד ומרכיבים לא-אורגניים אחרים בעיקר גיר וחרסיות. יחסי המרכיבים תלויים בעיקר באופטימיזציה של התחממות,,pH ורטיבות אופי ההדברה ומנגנון הפעולה של הבמ"ס הפעילות הביוצידית בנוכחות של הבמ"ס מבוססת על יצירת ph גבוה בקרקע בה האמוניום המצוי הוא בצורתו הגזית ) 3.(NH הבמ"ס גם תורם אמוניום למערכת. בריכוז NH 4 נתון, ריכוז + ה- NH 3 תלוי ב- ph. ה ph הסופי בקרקע, תלוי בעומס הבמ"ס בקרקע, בתכולת הסיד הפעיל שנותרה בו ובכושר הבופר של הקרקע (2008 al., (Zasada et לפיכך, ניתן לצפות כי היעילות הביוצידית של הבמ"ס בקרקע חולית תהיה גבוהה יותר, באותם תנאים, בהשוואה לקרקע חרסיתית ולכן יהיה צורך בהתאמה של סוג וכמות הבמ"ס לתכונות הקרקע. 11

19 ל/ 3. שיטות וחומרים 3.1 מצעי מזון הרכבי מצעי המזון ששימשו בעבודה הנוכחית, הכמויות ניתנות בג' ' מים מזוקקים. מצע, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Sclerotium rolfsii) PDA (Difco, Becton, Dickinson and Company),(Rhizoctonia solani PDA Agar Bacteriological Chloramphenicol Bacto Yeast Extract א. ב. ג. ד. מצע (Dhingra and Sinclair,1995),(Verticillium dahliae) Czapek NaNO 3 K 2 HPO KCl 0.50 MgSO 4 *7H 2 O FeSO 4 *7H 2 O 0.01 Sucrose Chloramphenicol 0.25 Bacto-Agar מצע (Okon et al. 1973),(Sclerotium rolfsii ) SM NaNO 3 K 2 HPO KCl 0.50 MgSO 4 *7H 2 O FeSO 4 *7H 2 O 0.01 D-Glucose Yeast Extract 0.10 מצע Difco,(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) NB (and BBL Manual) KHPO 4 Nutrient Broth D-Glucose Bacto Yeast Extract L-Asparagine

20 Bacto Agar (Difco) אגר מים solani) (Rhizoctonia ה. KH 2 PO 4 NaNO 3 מצע,F. oxysporum f. sp. dianthi) PDAS קישיוניות של Sclerotinia sclerotiorum ו. ו rolfsii (Sclerotium PDA Streptomycin 0.25 את ה Streptomycin מוסיפים לאחר העיקור. מצע (Nash and Snyder, 1962),(F. oxysporum f. sp. dianthi) Nash ז. Bacto peptone MgSO4*7H2O 0.50 Chloramphenicol 0.20 Powdered PCNB 1.00 Agar עיקור 10 דקות, כאשר מצטנן ל C 70 0 מוסיפים 0.2 ג' סטרפטומיצין-סולפט וכן את ה PCNB.(pentachloronitrobenzene) מצע Ausher (מיקרוסקלרוציות של (Ausher et al., 1975)(Verticillium dahliae ח K 2 HPO MgSO4*7H2O KCl Chloramphenicol Powdered PCNB (75%) Sucrose FeSO4*7H 2 O Agar עיקור 20 דקות, כאשר מצטנן ל C 70, 0 מוסיפים 140 מ"ג סטרפטומיצין-סולפט. 3.2 בדיקות כימיות בדיקות כימיות ששימשו בעבודה הנוכחית. א. בדיקת ph ו מוליכות חשמלית,(EC).( Sparks et al.,1996) קרקע יובשה ב C 45 0 למשך 48 שעות. לאחר הייבוש, הקרקע נטחנה לגודל אחיד של 2 מ"מ. מנות של 5 גרם קרקע הוכנו במבחנות סרכוז בנפח של 50 מ"ל. לכל מבחנה הוספו 25 מ"ל מים מזוקקים, המבחנות טולטלו במטלטלת למשך שעה, סורכזו במשך 10 דקות ) 4733 rpm, 6000 g). הבדיקות בוצעו בנוזל הצלול. מוליכות חשמלית נבדקה באמצעות 13

21 ה, ph-meter Mettler - ph נבדק באמצעות EC-meter Denver Instruments model 50 Delta 320 ב. בדיקת זרחן ואשלגן מינראלי al.,1996) ). Sparks et קרקע כנ"ל במשקל של 1 גרם הוכנה במבחנות סרכוז בנפח של 50 מ"ל. לכל מבחנה הוספו 20 מ"ל תמיסת.(pH=8.5) 0.5 M NaHCO 3 המבחנות טולטלו למשך 3 שעות, ולאחר מכן סורכזו במשך 10 דקות. התרחיף סונן בנייר סינון (41 No. (Whatman אל תוך בקבוקון פלסטיק, ואליו הוספו 0.4 מ"ל H 2 SO 4 (יחס 2:3 חומצה מרוכזת למים), התסנין הושאר בבקבוקים פתוחים למשך הלילה לשם נידוף הגז. האשלגן נבדק ב - sherwood,flame Photometer M410 הזרחן נבדק באמצעות ריאקצית צבע קולורימטרית באוטואנלייזר Lachat autoanalyzer.(milwaukee, WI) ג. בדיקת אמון וחנקה Mulvaney,1996).(Sparks and קרקע כנ"ל במשקל של 2.5 גרם הוכנה במבחנות סרכוז בנפח של 50 מ"ל. לכל מבחנה הוספו 20 מ"ל תמיסת 1. N KCl המבחנות טולטלו למשך שעה, ולאחר מכן סורכזו במשך 10 דקות. התרחיף סונן בנייר סינון (41 No..(Whatman צורות החנקן המינראלי (אמון, חנקה וחנקית) נבדקו באוטואנלייזר.(Milwaukee, WI) Lachat autoanalyzer ד. בדיקות בוצה ובמ"ס. אחוז רטיבות ייבוש בתנור (C 105) 0 למשך 48 שעות. בדיקת ph ו EC במיצוי 1:5 כמו הקרקע (רטוב ללא ייבוש). בדיקת אמון וחנקה (חנקן מינראלי) - לאחר בדיקת הרטיבות, מחשבים את פקטור הרטיבות על מנת להגיע ליחס של 8:1 (קרקע/תמיסת,(KCl 2.5 גרם ל 20 מ"ל תמיסת. 1 N KCl (רטוב ללא ייבוש). זרחן ואשלגן מינראלי נבדקים באותה שיטה כמו בקרקע (לאחר ייבוש). ה. חנקן וזרחן כללי שיטת קלדהל.(Bremner,1965) שוקלים מ"ג של הזבל האורגני היבש (הכמות משתנה לפי סוג הזבל), מוסיפים תערובת קטליזאטור (Kjeldahl) במשקל של 1.1 גרם ו 3 מ "ל של H, 2 SO 4 שריפה מתבצעת על פלטת חימום למשך מינימום של 5 שעות עד שכל התמיסה הופכת ללבנה. לאחר קירור מוהלים ל 100 מ"ל עם מים נטולי יונים. מניחים לנוזל להצטלל במשך 24 שעות. ובודקים באוטואנלייזר.(Milwaukee, WI) Lachat autoanalyzer 14

22 ו. בדיקת חומר אורגני (1996 al.,.(sparks et מנה של 2 גרם (לאחר ייבוש ב C 45 0 וטחינה) מועברת לייבוש ב - (C 105) 0 למשך 24 שעות, ונשקלת מחדש. מכניסים לתנור ל - C למשך 8 שעות, לאחר מכן מעבירים לדיסקטור לקירור, שוקלים ומחשבים את אחוז החומר האורגני. ז. פחמן אורגני 1996) al.,.(sparks et שיטה יבשה, לאחר ייבוש ב C 45 0 וטחינה, בודקים כמות ידועה של קרקע במכשיר C/N 900, 0 C - השיטה מבוססת על שריפת הדוגמא ב.Thermo Finigen של חברת analyzer הפיכת החנקן והפחמן לגז חנקן ולפד"ח ) 2 (CO והפרדה ביניהם באמצעות קולונת,GC מדידת הריכוזים באמצעות דטקטור Flash EA 1112 Series TC כנגד סטנדרטים מתאימים. בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הפתוגנים המחלות. והתפתחות 3.3 בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת הפתוגנים:.F,Sclerotium rolfsii,verticillium dahliae,oxysporum f. sp. dianthi - Sclerotinia sclerotiorum בתנאי מעבדה הדברת פוזריום בקרקע בית דגן בניסוי זה השתמשנו בקרקע חול סייני (טבלה 2) מאולחת באופן טבעי בפטרייה.F oxysporum.f. sp. dianthi לקרקע במשקל 50 גרם הוספו צירופי הטיפולים הבאים: 4 רמות של במ"ס (0,1, 1.25 ו 1.5 גרם). הבמ"ס נלקחה ממט"ש בית שמש. החומר נופה באמצעות נפה של 1.2 מ"מ, ועורבב בקרקע בשלוב עם 4 רמות של אמון גופרתי (0, , ו 50 מ, "ג). כל צירוף נבחן ב 4 חזרות, וכל הניסוי נעשה 3 פעמים. מדגמי הקרקע עם התוספים השונים הודגרו ב - C 25 0 בתכולת מים של קיבול שדה. שיעור ההדברה וה ph נבדקו לאחר 4 2, 1, ו - 8 ימים. 5 ג' של קרקע נלקחו מהחלק העליון של הכלי, והורחפו ב 45 מ"ל של אגר מים (w/v,0.1%) שעבר אוטוקולב. לאחר מכן, 1 מ "ל של מיהול מתאים נמרח על 3 צלחות אגר עם מצע גידול סלקטיבי.(Nash) חמישים מהמושבות שהתפתחו על מצע זה הועברו למצע PDAS על מנת לקבוע את מספר הפרופגולים/ג' קרקע של..F oxysporum.f sp. dianthi ה ph נקבע על דוגמת קרקע מקבילה כמו שתואר לעיל הדברת פוזריום בשלוש קרקעות (חול סייני, סין חולי וחרסית) בניסוי זה נוספו 2 קרקעות בנוסף לקרקע חול סייני, הטיפולים היו כדלקמן: קרקע חול סייני: 50 גרם קרקע עם 6 רמות של במ"ס: , 0.75, 0.5, 0, ו 2 גרם. 15

23 קרקע סיין חולי: 50 גרם קרקע עם 6 רמות של במ"ס , 0.75, 0.5, 0, ו 2 גרם. קרקע חרסית: 50 גרם קרקע עם 4 רמות של במ"ס , 0, ו 4.0 גרם. בכל הטיפולים הוספה כמות אמון גופרתי אחידה: 50 מ"ג/כלי. משך ההדגרה היה 8 4, 1, ו 16 ימים. המדדים שנבדקו היו ההפחתה במספר הפרופגולים של.F oxysporum.f sp. dianthi בקרקע, והשתנות ה - ph של מיצוי תמיסת הקרקע. הבדיקות נעשו כדלעיל. טבלה 1: תכונות כימיות ופיזיקליות של הקרקעות בניסויי המעבדה. גיר כללי ph (% w/w) הרכב מכני (% w/w) קרקע סילט חול חרסית קק"ח (מא"ק/ 100 ג') פחמן אורגני (%) מים בקיבול שדה (% w/w) חול סייני סיין חולי חרסית הדברת גופי קיימא של,Verticillium dahliae,sclerotinia sclerotiorum Sclerotium rolfsii ופרופגולים של פוזריום בקרקע בית דגן בניסוי זה השתמשנו בקרקע חול סייני (טבלה 1) מאולחת באופן טבעי בפטרייה.F oxysporum.f. sp. dianthi לקרקע במשקל 50 גרם, הוספו צירופי הטיפולים הבאים: 2 רמות של במ"ס (0 ו 2 גרם). הבמ"ס נלקחה ממט"ש בית שמש. החומר נופה באמצעות נפה של 1.2 מ"מ, ועורבבה בקרקע בשלוב עם 2 רמות של אמון גופרתי (0 ו 50 מ"ג). בכל אחד מהצירופים הושמו 10 חלקי גבעול עם מיקרוסקלרוציות של Verticillium dahliae ו - 10 קישיונות של Sclerotinia sclerotiorum ו rolfsii Sclerotium בעומק של 1 ס"מ. הקרקע הורטבה לקיבול שדה והושמה בהדגרה למשך 4 ימים ב C לאחר תקופת ההדגרה גופי הקיימא הופרדו מהקרקע והושמו במצע גידול מתאים. נביטת המיקרוסקלרוציות עבור Verticillium dahliae נבדקה במצע.Ausher נביטת הקישיוניות עבור Sclerotinia sclerotiorum ו rolfsii Sclerotium נבדקה במצע.PDAS מספר הפרופגולים/ג' קרקע של.F oxysporum.f sp. dianthi שהודברו נבדקו במצע.PDAS כל צירוף נבחן ב 3 ניסויים חוזרים, כל ניסוי ב 4 חזרות. 16

24 בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת פתוגנים ) oxysporum.f Verticillium dahliae,f. sp. dianthi ו - solani ( Rhizoctonia בניסוי גידול תפו"א במכלים הטיפולים היו לפי הפירוט הבא: טבלה 2: הרכב הטיפולים בניסוי תפו"א במכלים, שנת 2000 חנקן אמוניקאלי (מ"ג/ק"ג) אחוז במ"ס טיפול כל טיפול היה ב - 7 חזרות, תבנית הניסוי: בלוקים באקראי. כל חזרה הייתה חבית פלסטיק בנפח של 60 ליטר. הרכב המכל מהתחתית כלפי מעלה היה בהתאם למפרט הבא: החלק התחתון ) 5 ס "מ מהתחתית) מולא בחצץ גס (ניקוז) ומעליו רשת. 1. חול גס עד לגובה של 25 ס"מ מפני החבית. 2. מילוי נוסף עד לפני החבית (קרקע לס מגילת מאולחת ב dahliae (Verticillium עומק 3. של 20 ס"מ. כל חבית הייתה מנוקבת בתחתית לשם איסוף מי נקז, המי נקז נאספו באשפתון של ליטר ונדגמו אחת לשבוע. הטיפולים היו תערובת של קרקע לס מגילת עם במ"ס וחנקן אמוניקאלי בכמויות שונות. ההרכבים השונים עורבבו במערבל בטון ומשם נלקחו לפיזור בחביות. מקור החנקן המוסף היה אמון גופרתי. לטיפול הביקורת הוספנו גראון בכמות של ג' לחבית על מנת להשוות את רמת הזרחן והאשלגן בטיפולים אלה עם טיפולי הבמ"ס. בכל החביות יושמו מארזי פתוגנים (חתיכות גרב ניילון), מארזים אלה נקשרו לחוט ונטמנו בעומקים שונים על פי הסדר הבא: - F. oxysporum f. sp. dianthi 3 סטים (עומק, ס"מ ו ס"מ) לחבית. בכל מארז, קרקע בית דגן מאולחת טבעית בפטרייה. Verticillium dahliae 2 סטים (עומק , ס"מ) לחבית. בכל מארז, קרקע בית דגן מעורבבת עם חתיכות גבעולי תפו"א המכילים מיקרוסקלרוציות של הפטרייה. - Rhizoctonia solani 2 סטים (עומק , ס"מ) לחבית. בכל מארז, קרקע בית דגן מעורבבת עם חתיכות גבעולי תפו"א המכילים קשיונות של הפטרייה , יישום המארזים בקרקע , (מכל סט של יישום החומר בחביות מארזים הושארו מארזים לשם קביעת רמת האפס), כיסוי בפוליאתילן (0.04 מ"מ) , הורדת פוליאתילן , השקית הרוויה, זריעה של 3 פקעות מזן דזירה לחבית - 17

25 מנת המים במהלך עונת ההשקיה הייתה 0.5 ליטר ליום בשלב הנביטה הצצה, ועלה למקסימום של 3 ליטר למכל בתקופת מילוי הפקעות. יבול הפקעות נאסף לאחר 110 יום מהזריעה. במהלך הניסוי בוצעו דגימות קרקע לבדיקות כימיות,pH) N-NH 4,EC ו 3 (N-NO בזמנים הבאים: 21 14, 7, 0, ו 28 יום לאחר היישום. במקביל נלקחו מדגמי קרקע לכימות אוכלוסיות של F. oxysporum f. sp. dianthi בקרקע, בזמנים הבאים: 10,3 ו 14 יום לאחר היישום. הערכת פטריות כללי התבצעה 10 ימים לאחר היישום. המארזים הוצאו מהקרקע 14 יום לאחר יישום החומר. עם הוצאת המארזים מהקרקע, הם הושמו לייבוש אוויר, לאחר מכן הקרקע + חתיכות הגבעולים הועברו דרך מסננת, הגבעולים המופרדים הועברו לחיטוי בתמיסת אקונומיקה (1%), לאחר מכן נשטפו במים סטריליים והועברו לזריעה למצעים המתאימים (ריזוקטוניה אגר מים, וורטיציליום מצע.(Ausher הקרקע המופרדת עברה מהולים ונזרעה על מצע.PDA בדיקת השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת sp..f oxysporum.f dianthi בגידול ציפורן במיקרו-חלקות ניסוי ראשון 1999/2000 אתר הניסוי בית דגן, הניסוי כלל 2 טיפולים: יישום במ"ס בקרקע, בשיעור של 4% ממשקל יבש של שכבת קרקע בעומק 0 20 ס"מ (שווה ערך ל 10 טון במ"ס לדונם) בתוספת אמון גופרתי בשיעור של 250 מ"ג N-NH 4 לק "ג קרקע, התוספים הוצנעו לעומק של 20 ס"מ באמצעות קלשון. ביקורת ללא תוספים. גודל כל חזרה היה 1 מ"ר. מס' חזרות לכל טיפול 8, תבנית הניסוי בלוקים באקראי. לאחר יישום החומרים, החלקה קיבלה השקיה של 30 מ"ק לדונם, לאחר שהקרקע התנקזה והגיעה לקיבול שדה, פרשנו פוליאתילן (0.04 מ"מ) על כל אחד מהטיפולים למשך שבוע. נשתלו צמחים לחזרה מהזן ליאור. השקיה הייתה בהמטרה. יישום התוספים היה ב , שתילה , סיום הניסוי בדיקות כימיות: במהלך הגידול נלקחו מדגמי קרקע מכל חזרה לבדיקות כימיות של,EC,pH ובדיקת.N-NH 4 בדיקות פתוגנים: במהלך הגידול נלקחו מדגמי קרקע מכל חזרה, מדגמי הקרקע נאספו מעומקים של , 0-20, ס"מ באמצעות מקדח קרקע (קוטר 7.5 ס"מ). דיגום הקרקע היה לשם אפיון מס' הפרופגולים של.F. oxysporum.f sp. dianthi מדגמי הקרקע עברו ייבוש אוויר למשך 3 שבועות, לאחר מכן נטחנו בעדינות באמצעות מכתש ועלי, ונופו באמצעות נפה של 250.μm מכל מדגם קרקע נלקחה מנה של 5 ג' קרקע. מנה זו נמהלה עם אגר מים (0.1%), ו 1 18

26 מ"ל מכל תרחיף הועבר באמצעות פיפטה ונזרע בצלחת פטרי שהכילה מצע.PDAS לכל חזרה נזרעו 5 צלחות פטרי. הערכת המחלה בצמחי הציפורן בסיום הניסוי ( ) נאספו כל הצמחים מ 16 חלקות הניסוי, בכל חלקה נספרו סה"כ מספר הצמחים, מס' צמחים חולים, מס' צמחים מתים, מס' ענפים בריאים וחולים בכל צמח, וסה"כ משקל צמחים חולים וצמחים בריאים. על מנת לקבוע את חומרת המחלה, הוחלט שצמח עם ענף חולה אחד מוגדר כצמח חולה ניסוי שני 2000/2001 אתר הניסוי בית דגן, הניסוי כלל 6 טיפולים: טבלה 3: פירוט הטיפולים בניסוי הדברת.F oxysporum.f sp. dianthi בגידול ציפורן, על פי הרכב וכמות התוספים (בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס), חנקן אמוניקאלי ובוצה), בית דגן.2000/2001 טיפול במ"ס (טון/דונם) מקור החנקן המוסף היה אמון גופרתי 1 חנקן צרוף (ק"ג/דונם) בוצה (טון/דונם) מס' החזרות בכל טיפול היה 8, תבנית הניסוי בלוקים באקראי. התוספים הוצנעו לעומק של 20 ס"מ באמצעות קלשון. לאחר יישום החומרים, החלקה קיבלה השקיה של 30 מ"ק לדונם, לאחר שהקרקע התנקזה והגיעה לקיבול שדה, פרשנו פוליאתילן (0.04 מ"מ) על כל אחד מהטיפולים למשך שבוע. נשתלו צמחים לחזרה מהזן ליאור. ההשקיה היתה בהמטרה. יישום התוספים היה ב , שתילה , סיום הניסוי בדיקות כימיות ופתוגנים ראה סעיף (1999/2000) לעיל. הערכת המחלה בצמחי הציפורן. בסיום הניסוי ( ) נאספו כל הצמחים מ 48 חלקות הניסוי. בכל חלקה נספרו סה"כ מספר הצמחים, מס' צמחים חולים, מס' צמחים מתים, מס' ענפים בריאים וחולים בכל צמח, וסה"כ משקל של הצמחים. על מנת לקבוע את חומרת המחלה, הוחלט שצמח עם ענף חולה אחד מוגדר כצמח חולה. 19

27 ט( בדיקת השפעת תוספי במ"ס, CKD (אבק כבשני מלט) וחנקן אמוניקאלי על הדברת Verticilliumו dahliae - solani Rhizoctonia בגידול תפו"א הניסוי נערך בחוות גילת בנגב, בעונת הגידול הסתווית, הזן שנזרע היה ניקולה, תאריך הזריעה היה וכלל 7 טיפולים ב - 6 חזרות בתבנית בלוקים באקראי. סדר פעולות אגרוטכניות עד לזריעה: השקיה ב - 40 עד 50 מ"ק לדונם, חריש, דסקוס, מתלם, תיחוח ראשון, יישום דשנים - הוספת סופרפוספט ק"ג לדונם ב- 15 לאוגוסט, פיזור במ"ס + בוצה ב - 16 ו - 17 לאוגוסט, הוספת CKD (אבק כבשני מלט) ואמון גופרתי ב 20 לאוגוסט, תיחוח שני, פריסת ניילון. לאחר כחודש הורדת הפוליאתילן (0.04 מ"מ), השקיה, זריעה, השקיה, ריסוס עשביה, השקיה. הניסוי כלל 6 טיפולים המפורטים בטבלה 4: טבלה 4: פירוט הטיפולים בניסוי הדברת Verticillium dahliae בגידול תפו"א על פי הרכב התוספים (בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס), חנקן אמוניקאלי, בוצה, ואבק כבשני מלט ((CKD) גילת.2000/2001 מ( טיפול N-NH 4 במ"ס CKD 1 בוצה "ג/ק"ג) (טון/דונם) (טון לדונם) ון לדונם) ה CKD מוסף לקרקע הואיל והערכנו כי העלייה ב ph בתוספת במ"ס בלבד לא תהיה מספקת. יישום הטיפולים היה 40 יום לפני הזריעה לעומק של 20 ס"מ. בכל טיפולי התוספים ניתנו 4.6 יחידות חנקן צרוף בתחילת עונת הגידול. בטיפול הביקורת ניתנו 21.5 יחידות חנקן צרוף במנות שבועיות לאורך עונת הגידול. בדיקות לדוררת. בדיקת גבעולים: מכל חזרה נדגמו 10 גבעולים, שעברו חיטוי חיצוני בטבילה ב- 0.3%, NaOCl לאחר מכן שטיפה במים מזוקקים, חיתוך לקטעים וריסוק במים סטריליים, ביצוע מיהולים עשרוניים וזריעה של 0.1 מ"ל על מצע,SA הדגרה למשך 10 ימים ב C ולאחר מכן ספירה של המושבות. בדיקת פקעות: מכל חזרה נדגמו 50 פקעות. מכל פקעת נלקחו 3 קטעים מאזור צינורות ההובלה, הקטעים הושמו על מצע SA והודגרו למשך 10 ימים ב- 27, 0 C לאחר 10 ימים נבדקה הנגיעות בקטעים (קטע אחד נגוע פירושו פקעת נגועה) 20

28 בדיקת קש: דיגום 50 גבעולים יבשים מכל חזרה לצורך בדיקה ויזואלית לנוכחות מיקרוסקלרוציות של הדוררת (אחוז גבעולים נגועים מסה"כ הגבעולים). פתוגנים נוספים: בדיקה ויזואלית של קולוטוטריכום בקש תפו"א, ובדיקה ויזואלית של כתמי כסף וריזוקטוניה בפקעות. השפעת ריכוז האמוניה, תכונות הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע. 3.4 בדיקת השפעת ריכוז אמוניה וסוג הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע, וריכוז האמוניה הגזית באווירת הקרקע נבדקו 6 קרקעות: נתניה, גילת, נחל עוז, בית דגן, גולן וראשון לציון (טבלה 5). הקרקעות עברו ייבוש וטחינה (שיטות וחומרים, סעיף 3.2) ואוכסנו בכלים סגורים בטמפרטורת החדר. טבלה 5: מס' תכונות כימיות ופיזיקאליות של הקרקעות הנבחרות (נתניה 8, ראשל"צ, נחל עוז, בית דגן, גילת וגולן 4). גולן 4 גילת בית דגן נחל עוז ראשל"צ נתניה 8 קרקע C Sl Ls Scl S Scl מרקם ph CaCO 3 (%) פחמן אורגני (%) קק"ח (מא"ק/ 100 ג') חול (%) סילט (%) חרסית (%) α תכולת מים atm) 1/3) β תכולת מים atm) 15) γ מים זמינים חול סייני Ls, חול,S סיין חרסיתי חולי,Scl חרסית,C סיין חולי Sl - α תכולת רטיבות בקיבול שדה (% משקלי), - β תכולת רטיבות בנקודת כמישה (% משקלי), - γ מים זמינים (% משקלי). לא נבדק חמשה גרם קרקע יבשה (ב C 105) 0 הוכנסו לכוס כימית בנפח 50 מ"ל. הכוס והקרקע הוכנסו למכל זכוכית בנפח 1 ליטר (4 כוסות למכל). המכל נאטם והוזרק לתוכו אמוניה גזית דרך פקק גומי (שסתום חד כיווני). ההזרקה הייתה בכמות השווה ל - אפס עד 40 מ"ג אמוניה לליטר אוויר. משך החשיפה היה 4 שעות זאת היות ונערך ניסוי שבחן את השתנות ריכוזי האמוניה השאריתית באווירת המכל עם קרקע גולן 4 כפונקציה של זמן חשיפה ולאחר 4 שעות הגענו לשיווי משקל 21

29 במערכת. כל טיפול (סוג קרקע וריכוז אמוניה) היה ב 4 חזרות. ניסוי הספיחה בוצע בטמפרטורה קבועה של C ריכוז האמוניה באוויר במכלים נבדק באמצעות דגימה של 60 מ"ל אוויר מהמכלים האטומים. נפח אוויר זה הוזרק ל 5 מ "ל של 0.01M HCl לשם קביעה קלורימטרית של ריכוז אמוניום באמצעות.(Milwaukee, WI) Lachat autoanalyzer ריכוז האמוניה הספוח חושב לאחר הפחתת ריכוז האמוניה באווירת המכל מריכוז האמוניה המוזרק. ספיחת האמוניה לכלי (מכל זכוכית+ 4 כוסות כימיות) נבדקה בהתאם לתהליך שצויין לעיל (ריכוזי אמוניה (0-40 מ"ג/ליטר) וזמן חשיפה של 4 שעות) ונמצאה זניחה. בדיקת השפעת רטיבות הקרקע, וה ph של תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע מנת קרקע במשקל של 5 ג' הוכנסה לכוס זכוכית ופוזרה באופן אחיד על תחתית הכוס, הקרקע הובאה לתכולת רטיבות של קיבול שדה או 50% מים זמינים (% משקלי). הרטבת הקרקע בוצעה ע"י ריסוס עדין (גודל טיפות קטן, שהרטיבו באופן אחיד את פני הקרקע), לפי שקילה. בוצעו 2 הרצות של בדיקות: תמיסה של מים מזוקקים (ph=7.0) ותמיסה של,pH=10.3 בופר ביקרבונט תוצרת.(Thermo-Orion) לאחר הגעה למשקל הרצוי, פני הכוס נאטמו ע"י פרפין, וכוסות הוחזקו בטמפרטורה של 25 0 C למשך כשעה, על מנת להגיע לאחידות בפיזור המים במדגם. המשך התהליך מצוין לעיל בסעיף בדיקת השפעת ריכוזי האמוניה וזמני החשיפה על הישרדות הפתוגנים ) in.(vitro 3.5 בדיקת השפעת ריכוז אמוניה וזמן חשיפה על הישרדות תפטיר של Fusarium Verticillium dahliae Sclerotium rolfsii,oxysporum f. sp. lycopersici ו -.Rhizoctonia solani לכל אחת מהפטריות התבצעו 2 ניסויים. הניסוי הראשון היה לשם הערכה מקורבת של רגישות הפטריות לריכוזי אמוניה שונים ולזמני חשיפה. הניסוי השני התכוונן לתחום צר יותר של ריכוזים וזמני חשיפה על מנת לקבל אופיין התנהגות שישקף ערכים עולים של עיכוב עד לתמותה המוחלטת. ארבע הפטריות גדלו במצעים הבאים: א. F. oxysporum f. sp. lycopersici מצע.PDA ב. Sclerotium rolfsii מצע.SM ג. Verticillium dahaliae מצע.Czapek-dox 22

30 ד. Rhizoctonia solani מצע.PDA צלחות הפטרי עם 4 הפטריות היו בהדגרה בטמפרטורה של 27 0 C בחושך עד ש- 75% מכלל הצלחת התמלא בתפטיר. דסקיות בקוטר 15 מ"מ הוצאו מהיקף המושבה והונחו על דסקיות צלופן בקוטר 20 מ"מ (הצלופן עבר טיפול מקדים במים רתוחים, על מנת להגביר את חדירותו), שהונחו על צלחות פטרי עם המצע המתאים לכל פטרייה. לאחר שתפטיר הפטרייה מילא את כל דסקית הצלופן, הדסקית הועברה למכל בנפח של 1 ליטר. בכל מכל הונחו 6 חזרות לכל פטרייה, המכל נאטם והוזרק לתוכו אמוניה גזית דרך פקק גומי (שסתום חד כיווני). תחום הריכוזים היה 0-50 מ"ג אמוניה /ליטר אויר, ומשך החשיפה היה 0-30 דקות בהתאם לרגישות הפטרייה. לאחר החשיפה לאמוניה, דסקיות הצלופן עם התפטיר עליהם, הועברו לצלחות פטרי חדשות עם המצע המתאים והודגרו בחושך ב C למשך מס' ימים ).F oxysporum f. sp. lycopersici למשך 7 ימים, Verticillium dahaliae למשך 10 ימים, Sclerotium rolfsii למשך 4 ימים ו - solani Rhizoctonia למשך 3 ימים). קוטר המושבות נמדד מידי 24 שעות על מנת לקבוע את שיעור הגדילה. בדיקת השפעת ריכוז אמוניה ומשך חשיפה על הישרדות גופי קיימא של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,sclerotium rolfsii ו-.Verticillium dahliae במקביל לבדיקת השפעת האמוניה על התפטיר, גודלו במצעים המתאימים גופי קיימא של הפטריות להלן: א. F. oxysporum f. sp. Lycopersici כלמידוספורות ב. dahaliae -Verticillium מיקרוסקלרוציות ג. Sclerotium rolfsii קישיוניות. לאחר הבשלת גופי הקיימא (מספר חודשים), הם נאספו בהתאם לתהליכים הבאים: קישיוניות של Sclerotium rolfsii נאספו מצלחות הפטרי ומוינו בהתאם לגודל. במקרה של.F (d=4mm) ייצרנו דסקיות מצע יבש Verticillium dahaliae - ו oxysporum f. sp. lycopersici שהכילו כלמידוספורות ומיקרוסקלרוציות באמצעות מחורר פקקים. גופי הקיימא הונחו במכלים בנפח של 1 ליטר, ובכל מכל הושמו קישיוניות או דיסקיות. המכל נאטם והוזרקה לתוכו אמוניה גזית. תחום הריכוזים היה 0-50 מ"ג אמוניה /ליטר אויר, ותחום זמן החשיפה היה 0-30 דקות. לאחר החשיפה, גופי הקיימא הועברו לצלחות פטרי חדשות עם המצע המתאים והודגרו בחושך ב C במשך 6 ימים. נבדקה נביטה של גופי הקיימא כל 24 שעות, על מנת לקבל הערכה של אחוזי נביטה של כל פטרייה. לאחר קביעת הריכוזים המזעריים הדרושים לקטילה מלאה של כל אחת מהפטריות, נבדקה חיוניות גופי הקיימא בריכוזים שאינם גורמים לקטילה מוחלטת. לשם ביצוע הבדיקה נחשפו גופי קיימא של.f.F oxysporum sp. lycopersici ו - dahaliae Verticillium לריכוזים מעכבים של אמוניה, הודגרו 24 שעות על 23

31 גבי מצע מזון מתאים, ואז הועברו לצלחות פטרי ללא מצע מזון למשך 48 שעות נוספות. תהליך זה חזר 3 פעמים כשבכל פעם נבדקה יכולת גופי הקיימא לנבוט מחדש. ביטוי חזותי של השפעת ריכוזי אמוניה שונים על גדילה והסתעפות של קורים התבצע בתפטיר של Rhizoctonia solani ו - rolfsii Sclerotium שגודל על דסקיות צלופן, הדסקית + התפטיר נטבלה בתמיסת (W/V) 0.05% של brightener) Calcofluor White M2R new (fluorecent ונשטפה בבופר פוספט 7.0) (0.1 M ph בהתאם למפרט 1978) al.,.(kritzman et לאחר הצביעה התפטיר נחשף לרמות שונות של אמוניה solani),rhizoctonia ריכוז אמוניה של 0 ו 10 מ"ג לליטר אוויר, זמן חשיפה של 20 דקות.,Sclerotium rolfsii ריכוז אמוניה של 0 ו 1.5 מ"ג לליטר אוויר, זמן חשיפה של 10 דקות). בגמר החשיפה, הדיסקית+התפטיר נלקחה להדגרה למשך כשעתיים, ולאחר מכן הועברה להסתכלות וצילום באמצעות מיקרוסקופ בעל תאורת אולטרא סגולה - Germany Ultraviolet light microscope HBO 50, ZEISS, בדיקת השפעת ריכוז האמוניה ותכונות הקרקע על שרידות תפטיר של Sclerotium rolfsii ו Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici בקרקע. 3.6 שתי הפטריות גודלו בצלחות פטרי (מצע (PDA על גבי צלופן. לאחר כ 5 ימים דסקיות תפטיר + צלופן בקוטר 2 מ"מ הושמו במצע נוזלי ) rolfsii Sclerotium מצע PDA ללא אגר), lycopersici) Fusarium oxysporum f. sp. מצע (NB בארלנמירים של 250 מ"ל, נפח המצע הנוזלי היה 50 מ"ל. הארלנמירים הושמו במטלטל Line) (Orbit shaker,lab במהירות של 150 rpm בטמפרטורת החדר, למשך 18 שעות עבור Sclerotium rolfsii ולמשך 24 שעות עבור.Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici אסיף התפטיר נעשה ע"י מזיגת המצע הנוזלי + התפטיר דרך 4 שכבות של בד גבינה לתוך משפך בוכנר. רפידת התפטיר נשטפה באמצעות מים נטולי יונים להסרת עודפי המצע הנוזלי, והופעל וואקום לניקוז עודפי המים והמצע. תפטיר ה - rolfsii Sclerotium עבר ריסוק עם מים נטולי יונים באמצעות Janke-kunkel),(Ultra Turax, תפטיר ה - f. Fusarium oxysporum sp. lycopersici רוסק באמצעות בלנדר.(Waring) התערובת עורבבה עם 50 ג' קרקע יבשה וטחונה, לאחר מכן בוצעו סדרת מיהולים עד הגעה למספר המושבות הרצוי ) מושבות לג' קרקע). הקרקעות שבהם השתמשנו היו: גולן 4, נתניה 8, ראשל"צ ונחל עוז (טבלה 5). מנה של 5 ג' מכל קרקע מאולחת הוכנסה לכוס כימית בנפח 50 מ"ל. הכוסות הוכנסו למכל זכוכית בנפח 1 ליטר (4 כוסות למכל). המכל נאטם והוזרקה לתוכו אמוניה גזית. לאחר 4 שעות חשיפה לריכוזי אמוניה, תכולת הקרקע הועברה לשקית סטומכר והוספה ל- 45 מ"ל אגר מים. השקית טולטלה במשך שעתיים ב- 200 rpm ולאחר מכן הועברה למכשיר Stomacher

32 לטלטול מהיר למשך כדקה. בצענו סדרה של מהולים ולאחר מכן זרענו על מצע.PDA הצלחות הודגרו 4 ימים ב- 27, 0 C ונספרו המושבות. כל טיפול התבצע ב 4 חזרות. בחינת מנגנון הפעולה של אמוניה בתנאי מעבדה על Sclerotium rolfsii ו - lycopersici.fusarium oxysporum f. sp. 3.7 כללי הפטריות גודלו כדלעיל (סעיף 3.6). אסיף התפטיר נעשה ע"י מזיגת המצע הנוזלי + התפטיר דרך 4 שכבות של בד גבינה לתוך משפך בוכנר. רפידת התפטיר נשטפה באמצעות מים מזוקקים פעמיים להסרת עודפי המצע הנוזלי, והופעל וואקום לניקוז עודפי המים והמצע. לאחר גמר הוואקום ייבשנו את שארית הנוזלים עם נייר סינון. רפידת התפטיר חולקה לחלקים שווים והוכנסה לתוך מבחנות.Eppendorf מבחנות אלה הושמו בקרח (לבדיקת דליפה מהתאים) או הוקפאו בחנקן נוזלי והושמו במקפיא ב C התפטיר שימש אח"כ לבדיקות הבאות: פעילות אנזימתית, כימות רמת,ATP וחישוב ח"י. כל התהליכים המוזכרים לעיל התבצעו בתנאים סטריליים. בדיקת דליפה של אשלגן, חנקן אורגני וגלוקוז מתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו rolfsii Sclerotium לאחר חשיפה לאמוניה רפידת התפטיר חולקה למנות של 1 ג' משקל טרי כל אחת. כל מנה הוכנסה לכוס כימית בנפח של 50 מ"ל. כל טיפול כלל 4 כוסות. הכוסות הוכנסו למכל בנפח 1 ליטר. המכל נאטם והוזרק לתוכו אמוניה גזית דרך שסתום חד כיווני. ריכוזי האמוניה היו: מ"ג אמוניה לליטר אוויר עבור Sclerotium rolfsii ו 0-16 מ"ג אמוניה לליטר אוויר עבור sp. Fusarium oxysporum f..lycopersici זמן החשיפה היה 20 דקות. לאחר גמר החשיפה, הכוסות עם התפטיר הועברו למנדף למשך כ- 10 דקות, על מנת לנדף את שארית האמוניה. לכל כוס הוספו 20 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים, ולאחר כ 30 שניות המים יחד עם התפטיר סוננו בוואקום דרך נייר סינון µm).(glass Microfibre, 47mm, Whatman, pore size 1.2 את התמיסה שהתקבלה הפרדנו ל 2 מנות: א. מנה של 1.5 מ"ל במבחנת Eppendorf הוכנס להקפאה לבדיקת גלוקוז בהמשך. ב. מנה של 17.5 מ"ל בבקבוקון של 20 מ"ל לבדיקות כימיות: חנקן אורגני, חנקן אמוניקאלי, אשלגן, מוליכות חשמלית ו.pH הגלוקוז נבדק באמצעות Glucose (GO) Assay Kit של חברת סיגמא באמצעות.340 nm באורך גל של Spectrophotometer Spectronic 20 Genesys חנקן אמוניקאלי נבדק באמצעות autoanalyzar Quickchem 8000, Lachat Instruments חנקן כללי נבדק באמצעות SKALAR-.TOC/TN analyzer חנקן אורגני חושב ע"י הפחתת 25

33 החנקן האמוניקאלי מהחנקן הכללי (לא היה חנקה או חנקית במדגמים שנבדקו). אשלגן נבדק באמצעות - 400,Flame photometer Corning מוליכות חשמלית באמצעות EC-meter.pH-meter Mettler Delta נבדק באמצעות ph,denver Instruments model 50 בדיקת פעילות האנזים גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) בתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו rolfsii Sclerotium לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים האנזים נבדק לפי מודיפיקציה של (2005) Punekar Noor and לאחר חשיפה לאמוניה כמתואר בסעיף (ריכוזי האמוניה היו: 0-3 מ"ג אמוניה לליטר אוויר עבור Sclerotium rolfsii ו מ"ג אמוניה לליטר אוויר עבור Fusarium oxysporum.f sp. lycopersici זמן החשיפה היה 20 דקות). כל תהליכי מיצוי וניקוי האנזים התבצעו בטמפרטורה של 4. 0 C קורי פטרייה מוקפאים נטחנו במכתש ועלי שקוררו מראש עם כמות זהה של חול (w/w) שטוף בחומצה. העיסה עורבבה עם תמיסת מיצוי (1 ג' תפטיר ל מ 5 "ל תמיסת מיצוי) מקוררת של בופר NADP-GDH המכיל: 1.0 mm EDTA,1.0 mm 2-mercaptoethanol,100 mm potassium phosphate ו - PMSF 1.0 mm ב- ph סופי של 7.5 למשך דקה. התפטיר + תמיסת המיצוי סונן דרך 2 שכבות של "בד גבינה". התסנין סורכז בצנטריפוגה min) rpm, g, 4 0 C, 20.(Sorvall Super T21 הנוזל שהתקבל לאחר הצנטריפוגה היה מיצוי גס של האנזים. פעילות האנזים נמדדה בטמפרטורה של C פעילות ה - NADP-GDH נמדדה ע"י שינוי בבליעה באורך גל של 340 nm ב - Genesys.Spectrophotometer Spectronic 20 ראקציית החיזור (אמינציה) נקבעה בנפח תמיסה של 1 מ"ל בהרכב הבא: 150 מיקרוליטר תמיסת אנזים, 0.1 mm 10 mm 2-oxoglutarate,10 mm NH 4 Cl,(pH=8.0) 100 mm Tris/HCl ו -.NADPH הריאקציה מתחילה עם הוספת.NADPH ריאקצית החמצון (דאמינציה) מתבצעת בנפח תמיסה של 1 מ"ל בהרכב הבא: 150 מיקרוליטר של תמיסת אנזים, 100 mm Tris/HCl,(pH=9.3) 100 mm L-glutamate ו - + NADP,0.4 mm הריאקציה מתחילה עם הוספת +.NADP הירידה (תהליך החיזור) או העלייה (תהליך החמצון) בבליעה A) נמדדה במשך 340nm ) 10 דקות (מדידה כל דקה). החישוב נעשה בהתאם למשוואות הבאות: (ΔA 340nm /minute test - (ΔA 340nm /minute blank)(l)(df) Units/ml enzyme = (6.22) (0.15) L = Volume (in milliliters) of assay df = Dilution factor 6.22 = Millimolar extinction coefficient of β-nadh at 340 nm 0.15 = Volume (in milliliter) of enzyme used 26

34 Units/ml enzyme Units/mg protein = mg protein/ml enzyme יחידה אחת של פעילות מוגדרת ככמות האנזים הדרושה לחזר/לחמצן mg ) U מוגדרת כ (Specific activity) פעילות ספציפית.1 μmol NADP + /NADPH min (protein כמות החלבון נמדדה באמצעות: RC DC Protein assay (Bio-Rad cat. # 500: ) בדיקת ריכוז ה - ATP בתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו rolfsii Sclerotium לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים מדגמי התפטיר המוקפאים הודגרו שעתיים בתמיסה של (TCA) 5% trichloroacetic acid (ה TCA משמש למיצוי ה ATP מתוך תאי הפטרייה), ו - EDTA 2 mm (ה EDTA מזרז אינאקטיבציה של אנזימים הפועלים על (ATP בטמפרטורה של 4. 0 C לאחר מכן התמיסה עברה הומוגינציה באמצעות טוחן רקמות,(Potter-Elvejhem) וההומוגנאט הוקפא בחנקן נוזלי ואוכסן במקפיא ב- C 78-0 ה. הומוגנאט הקפוא הופשר ונמהל פי 50 בתמיסת 20 mm tris acetate (ph=7.75) על מנת להפחית את ריכוז ה TCA ל 0.1% (למנוע עיכוב של פעילות ה (Luciferase ולהביא את ריכוז ה - ATP לתחום הרגישות של מכשיר המדידה. הראקציה למדידת ריכוז ה ATP מבוססת על התהליך הבא: Luciferase ATP+d-Luciferin+O 2 >Oxyluciferin+AMP+Pyrophosphate+CO 2 +Light (560nm) לעקומת הכיול השתמשנו בסטנדרטים של (Product code FL-AAS) Sigma בתחום ריכוזים של M לשם קביעת ריכוז ATP השתמשנו ב - Adenosine 5'-triphosphate (ATP) Bioluminescent Assay Kit של חברת סיגמא. קביעת ריכוז ATP נעשתה באמצעות מדידת פליטת אור של ההומוגנאט בנוכחות של קוקטייל אנזימים luciferin/luciferase של 2550) (Firelight, Analytical Luminescence Laboratory cat # 2003, באמצעות מכשיר,ATP במקביל למדידת ריכוז ה.bioluminometer (Sirius Single Tube Luminometer) מכל טיפול נלקח מיצוי קפוא, נשקל ויובש 24 שעות בלאופיליזר (1-L (Christ לשם קביעת תכולת ח"י במדגם. בדיקת פעילות האנזים ATPase בממברנות תאי התפטיר של Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים גידול Sclerotium rolfsii ראה סעיף 3.6, כל התהליכים שפורטו בסעיף 3.6 ובהמשך התבצעו בתנאים סטריליים. כל התהליכים התבצעו בטמפרטורה של 4, 0 C וכל הסירכוזים בוצעו ב -.Sorvall Super T21 27

35 פרוטוקול העבודה מסתמך על המאמר של (1988). Bowman and Bowman אסיף התפטיר נעשה ע"י שפיכת המצע הנוזלי + התפטיר דרך 4 שכבות של בד גבינה לתוך משפך בוכנר. רפידת התפטיר נשטפה באמצעות מים מזוקקים פעמיים להסרת עודפי המצע הנוזלי, והופעל וואקום לניקוז עודפי המים והמצע. לאחר גמר הוואקום ייבשנו את שארית הנוזלים עם נייר סינון. רפידת התפטיר חולקה לחלקים שווים והוכנסה לתוך מבחנות.Eppendorf מבחנות אלה הושמו ב - C 4. 0 מנה של 4 ג' תפטיר (משקל טרי) הוכנסה לארלינמייר בנפח של 125 מ"ל המכיל 33 מ"ל של תמיסת (50 mm Na 2 H 2 PO 4 *H 2 O,5 mm Na 2 EDTA,590 mm sucrose) WDM התאמת ה ph ל 7.1 היתה באמצעות.2 M KOH לתמיסת ה WDM הוספנו 70μl של 2-.mercaptoethanol תמיסת ה WDM 2-mercaptoethanol + סוננה דרך מסנן פרפר 0.22μm).(Millipore, 5 ארלינמיירים עם קורי הפטרייה והתמיסה נאטמו בפרפילם, וטולטלו עד שהקורים התפזרו באופן אחיד. דפנות התאים עוכלו באמצעות האנזים β - Glucuronidase Co.).(Type H1, Sigma Chemical 1.2 ג' תפטיר הומסו ב 12 מ"ל WDM למשך כ - 30 דקות. לכל ארלינמייר הוספו 3 מ"ל תמיסת אנזים. הארלנמיירים טולטלו ) shaker,lab Environ (Line במהירות של 100 rpm ב - C 30 0 במשך שעה. הקורים המעוכלים הועברו ל 5 בקבוקי צנטריפוגה מעוקרים של 250 מ"ל וסורכזו (pellets) ר) הו חק, והמשקע supernatant) הנוזל העליון.(8000 rpm,8414 g, 4 0 C, 20 min) נשטף ב מ"ל 0.68 M סוכרוז מעוקר. בצענו סירכוז נוסף ) 20 C, 8000 rpm, 8414 g, 4 0,(min הנוזל העליון הורחק, והמשקע הכיל קורים עם דפנות תאים מוחלשות. בשלב זה התבצעה החשיפה לאמוניה. המשקע הוכנס לכוס כימית בנפח של 50 מ"ל, סה"כ 4 כוסות. כל כוס הוכנסה למכל בנפח 1 ליטר והמכל נאטם והוזרקה לתוכו אמוניה גזית. ריכוזי האמוניה היו: 0.75, 0.5, 0, , מ"ג אמוניה לליטר אוויר. לאחר 20 דקות חשיפה לאמוניה, הכוסות הוצאו מהמכלים אך הושארו במנדף מספר דקות על מנת לנדף את שארית האמוניה. לכוסות הוספו 30 מ"ל תמיסת (Bovine serum albumin, 0.3% (w/w),1 mm Na 2 EDTA,330 mm sucrose) MPN וה ph הותאם ל 7.1 באמצעות 0.5, M KOH תמיסת ה - MPN סוננה דרך מסנן פרפר μm) (Millipore, 0.22 על מזרק. התמיסה + הקורים נטחנה בטוחן רקמות מזכוכית בנפח 50 מ"ל, ונעשתה הומוגינציה עם סיבוב אחד איטי (כ 1 דקה) של כותש טפלון ממונע rpm) 1100) 2500 rpm, 822 g, ) ה. הומוגנאט סורכז (Potter-Elvehjem-type glass tissue grinders) 4) 0,C 10 min בבקבוק צנטריפוגה בנפח 250 מ"ל. הנוזל העליון supernatant) ה) ועבר דרך בד גבינה על מנת לתפוס משקע שלא שקע בסירכוז. כל המשקעים הופרדו והורחפו ב 33 מ"ל של.(9500 rpm, g, 4 0 C, 30 min) 4 עד למיצוי נוסף. הנוזל סורכז 0 C - ונשמרו ב MPN לאחר הסירכוז, הנוזל נאסף לארלנמייר המכוסה בבד גבינה. המשקעים שהכילו בעיקר מיטוכונדריה, הורחפו בצורה עדינה ב 3 עד 4 מ"ל של MPM הוקפאו בחנקן נוזלי ואוכסנו ב C 28

36 הנוזל סורכז במבחנת צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל min).(10000 rpm, g, 4 0 C, 30 הנוזל, הופרד מכדוריות המשקע הקטנות (pellets) (המכילות תערובת של מיטוכונדריה וממברנות פלסמה שמורחקות) סורכז שוב min).(18500 rpm, g, 4 0 C, 40 על מנת להשקיע את ממברנות פלסמה. הנוזל הורחק במלואו בשאיבה, והמשקעים, ממברנות הפלסמה הורחפו באמצעות פיפטת פסטר ב EGTA-Tris 1,1 mm מ "ל/למבחנה glycol) Ethylene.((bis(β aminoethyl) -N-N-tetra acetic acid התאמת ה ph ל 7.5 נעשתה באמצעות.Tris base התמיסה הועברה לטוחן רקמות מזכוכית בנפח של 40 מ"ל. EGTA-Tris הוסף להשלמת הנפח ל - 30 מ"ל, ותרחיף הממברנות עבר הומוגנציה במשך כ 5 דקות. ממברנות הפלסמה עברו שיקוע מחדש ע"י סירכוז min).(18500 rpm, g, 4 0 C, 40 לאחר הרחקה מלאה של הנוזל, משקעי ממברנות הפלסמה הורחפו ב 2 מ "ל של,EGTA-Tris עברו הומוגינציה ידנית במטחנת רקמה של 4 מ"ל וחולקו למנות של 0.5 מ"ל במבחנות microfuge והוקפאו בחנקן נוזלי ב - C ממברנות הפלסמה עברו בין 2-3 מיצויים. פעילות ATPase בחלקי הממברנות נמדדה ב- 30, 0 C ע"י שחרור של פוספט אנאורגאני. לפעילות ATPase בממברנות הפלסמה השתמשנו בתערובת הבאה: 3 mm phosphoenolpyruvate,15 mm NH 4 Cl,5 mm MgCl 2,5 mm Na 2 ATP salt) 5 mm KN 3,25 μg pyruvate kinase,(monopotassium (עיכוב פעילות של ממברנות המיטוכונדריה),,10 mm piperazine-n,n'-bis(2-ethane-sulfonic acid) (PIPES) buffer התאמה ל ph של 6.7 עם Tris base לפעילות ATPase בממברנות המיטוכונדריה השתמשנו בתערובת הבאה:,25 μg pyruvate kinase,15 mm NH 4 Cl,5 mm MgCl 2,5 mm Na 2 ATP 3 mm phosphoenolpyruvate (monopotassium salt) ph התאמה ל,10 mm piperazine-n,n'-bis(2-ethane-sulfonic acid) (PIPES) buffer של 8.3 עם.Tris base חצי מיליליטר מתערובת הראקציה חולקה למבחנות פלסטיק חד פעמיות (למנוע זיהום עם זרחן). ועברה פרה אינקובציה של 30 דקות ב C ריאקצית ה ATPase התחילה ע"י הוספת הממברנות tube) 3-10) μg protein/assay במרווחי זמן ונעצרה לאחר דקות עם 1.25 מ"ל של Fiske-Subbarow reagent המכיל 0.25%. sodium dodecyl sulfate לאחר 10 דקות מעצירת הריאקציה במבחנה האחרונה, נמדדה פעילות ה - ATPase בספקטרופוטומטר ) 20 Spectrophotometer Spectronic.A 660 nm באורך גל של (Genesys 29

37 בדיקת השפעת ph ומוליכות חשמלית במצע הגידול על התפתחות התפטיר של.Sclerotium rolfsii ו Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici לשם בדיקת השפעת המוליכות החשמלית וה ph על גדילת תפטיר שתי הפטריות, הוכנו מס' הרכבים של מצעי מזון. המרכיב הבסיסי היה מצע PDA בתוספת של KOH ו KCl לשם קביעת רמות שונות של ph ומוליכות חשמלית במצע (טבלה 6) טבלה 6: אפיון תכונות (מוליכות חשמלית (Ec) ו (ph של מצעי מזון באמצעות יישום כמויות שונות של KOH ו KCl (ג') ב 100 מ"ל אגר.PDA ג( ג( ph Ec (ds/m) (' KCl (' KOH * מצע * כמות ל 100 מ"ל מצע (סעיף ( PDA תפטיר של Sclertium rolfsii נבחן על מצע 5,1 ו.6- תפטיר של sp. Fusarium oxysporum f. lycopersici נבחן בכל המצעים. כל שילוב של תפטיר ומצע נבחן ב 4 חזרות. 3.8 ניתוח סטטיסטי נתוני הניסויים נותחו באמצעות התוכנות JMP (גרסה 5.0.1) ו 2000 Excel על פי מתכונת הניסויים. הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו ברמת מובהקות של,Pχ0.05 וכללו ניתוחי שונות (ANOVA) על פי,Tuckey-Kramer HSD רגרסיה לינארית פשוטה ומסדר שני. בעת הצגת התוצאות מצוינים בכל מקרה המבחנים הסטטיסטים שבוצעו ורמת המובהקות. 30

38 4. תוצאות השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הפתוגנים והתפתחות המחלות. 4.1 השלב הראשון של המחקר עסק בקשר האפשרי בין שימוש בבמ"ס (בוצה מיוצבת בסיד) לבין הדברת גורמי מחלה שוכני קרקע. היפותזת העבודה הייתה שיישום בקרקע של במ"ס בתוספת חנקן אמוניקאלי מביא ליצירת ריכוזי אמוניה לטאליים לפטריות פתוגניות שוכנות קרקע. בחינת היפותזה זו כללה ניסיונות in vitro במעבדה וניסיונות בשדה. המשתנים שנבדקו היו: שרידות גורמי מחלה שונים בקרקע ) rolfsii Sclerotinia,Verticillium dahliae,scerotium Fusarium,Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,rhizoctonia solani,sclerotiorum,(oxysporum.f sp. dianthi סוגי קרקע (חול סייני, סיין חולי, חרסית, חרסית סילטית) ושיעורי יישום שונים של במ"ס וחנקן אמוניקאלי בקרקע. הניסיונות בחנו את השפעת התוספים וסוג הקרקע על שרידות גורמי מחלה. השפעת במ"ס וחנקן אמוניקאלי במספר קרקעות על הדברת הפתוגנים:.F S. sclerotiorum - ו V. dahliae, S. rolfsii,oxysporum f. sp. dianthi במעבדה בחלק זה של העבודה בוצעו 3 ניסויי מעבדה. בניסוי הראשון (טבלה 7) נבדקו שילובים בין כמויות שונות של במ"ס ואמון גופרתי מעורבבים בקרקע בית דגן (חול סייני) והשפעתם על ph הקרקע ואחוז ההדברה של פרופגולים של.F oxysporum.f sp. dianthi בזמני הדגרה שונים. ניתן לראות כי עליה בשיעור הבמ"ס המוסף לקרקע מעלה את ph תמיסת הקרקע ומעלה את אחוז ההדברה של הפטרייה, וכי גם במ"ס לבדו גורם להדברה מסוימת יחסית לביקורת ללא במ"ס. לעומת זאת אמון גופרתי ללא תוספת במ"ס לא גרם להדברה כלשהי. הדברה מירבית הייתה משילובים בין תוספת במ"ס ואמון גופרתי. כמו כן, לאחר יומיים, שיעור ההדברה היה גבוה יותר מאשר לאחר יום אחד. אחוז ההדברה המירבי (100%) הושג בשילובים הבאים: 1.25 ג' במ"ס + 50 מ"ג אמון גופרתי ל -50 ג' קרקע (יום הדגרה אחד) השקול ל 260 ק"ג אמון גופרתי טון במ"ס לדונם 2 (חישוב לפי משקל נפחי של 1.3 טון/מ"ק, שטח 1000 מ ועומק שכבת עיבוד של 0.2 מ', סה"כ משקל שכבת עיבוד לדונם 260 טון), 1.5 ג' במ"ס + 25 מ"ג אמון גופרתי ל - 50 ג' קרקע (2 ימי הדגרה) השקול ל 130 ק"ג אמון גופרתי טון במ"ס לדונם, 1.5 ג' במ"ס + 50 מ"ג אמון גופרתי ל -50 ג' קרקע (יום הדגרה אחד) השקול ל 260 ק"ג אמון גופרתי טון במ"ס לדונם. 31

39 טבלה 7: השפעת הוספת שיעורים שונים של בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) ואמון גופרתי על phהקרקע (קרקע חול סייני), והדברה של.F oxysporum.f sp. dianthi (מחושב באחוזים) יחסית לביקורת (ללא תוספים). Propagules of F.o. f. sp. dianthi (%) הדברה זמן הדגרה (ימים) ph הקרקע גרם במ"ס/ 50 ג' קרקע מ"ג אמון גופרתי/ 50 ג' קרקע 0 a 0 a 0 a 0 a a 0 a 0 a 0 a a 25 a 26 a 18 a c 84 c 85 c 75 bc c 91 c 90 c 80 bc c 98 c 98 c 92 c b 55 b 54 b 50 b c 98 c 97 c 92 c c 99 c 99 c 93 c c 100 c 100 c 100 c b 60 b 58 b 55 b c 99 c 99 c 94 c c 100 c 100 c 97 c c 100 c 100 c 100 c כל תוצאה מייצגת ממוצע של 3 ניסויים, ב 4 חזרות כל ניסוי. מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי Tuckey-Kramer.P 0.05,HSD הניסוי השני בחן הדברה בהשפעת אמון גופרתי ובמ"ס בקרקעות עם טווח רחב של תכונות כימיות ופיזיקאליות (טבלה 1). המדדים שנקבעו היו ה - ph של מיצוי תמיסת הקרקע במשך 16 ימי הדגרה, וההדברה של.F. oxysporum.f sp. dianthi בתום התקופה ניתן לראות כי ה - ph של תמיסת הקרקע עלה בכל הקרקעות ככל שעלה שיעור הוספת הבמ"ס (טבלה מס' 8). בשעורי הוספה הגבוהים מ 2 ג' במ"ס/ 50 ג' קרקע ) 10.4 טון מ"ס/דונם). בשעורי הוספה גבוהים מ 1.5 עד 2 ג' במ"ס/ 50 ג' קרקע ) 7.8 עד 10.4 טון מ"ס/דונם) - ph לא חוזר ה, לערכו בביקורת 16 יום מההוספה. בקרקע חול סייני שילוב של 1 ג' במ"ס/ 50 ג' קרקע + 50 מ"ג אמון גופרתי/ 50 ג' קרקע (5.2 טון במ"ס/דונם ק"ג אמון גופרתי/דונם) נתן 100% הדברה. בקרקע חרסיתית היה צורך להעלות לשילוב של 1.5 ג' במ"ס/ 50 ג' קרקע + 50 מ"ג אמון גופרתי/ 50 ג' קרקע (7.8 טון במ"ס/דונם ק"ג אמון גופרתי/דונם) על מנת לקבל את אותה תוצאה, ובקרקע חרסית סילטית שילוב 4 ג' במ"ס/ 50 ג' קרקע + 50 מ"ג אמון גופרתי/ 50 ג' קרקע ) 20.8 טון במ"ס/דונם ק"ג אמון גופרתי/דונם) הביא ל 76% הדברה בלבד למרות שה ph עלה לערכים דומים לאלה בהם הושגה 100% הדברה בקרקעות אחרות. 32

40 ניסוי 3 בחן את השפעת הוספת 2 ג' במ"ס/ 50 ג' קרקע + 50 מ"ג אמון גופרתי/ 50 ג' קרקע (10.4 טון במ"ס/דונם ואמון גופרתי 260 ק"ג אמון גופרתי/דונם) לקרקע חול סייני על ph תמיסת הקרקע ועל אחוז ההדברה של גופי הקיימא ופרופגולים של 4 פטריות שונות (טבלה 9), ניתן לראות שרק הוספת במ"ס לקרקע העלתה את ph תמיסת הקרקע באופן מובהק לעומת הביקורת. הוספת במ"ס בלבד לקרקע ללא אמון גופרתי משפיעה באופן חלקי על אחוז ההדברה של שתי פטריות בלבד, 20%) Sclerotium rolfsii הדברה) ו - dianthi F. oxysporum f. sp. (35% הדברה), רק שילוב של במ"ס עם אמון גופרתי הביא לשיעורי הדברה מושלמים של.100% טבלה 8: השפעת סוג הקרקע וכמות הבוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) על ph תמיסת הקרקע כתלות בזמן ממועד היישום, והדברת תפטיר של.F oxysporum.f sp. dianthi (מחושב באחוזים). (%) הדברה 16 סוג הקרקע ' ג במ"ס/ 50 ג' קרקע ph תמיסת הקרקע זמן (ימים) c 8.42 b 8.47 c 8.50 d 8.53 f 0.00 חול סייני 91 b 8.31 b 8.31 c 8.41 d 9.03 e a 8.39 b 8.47 c 8.52 d 9.50 d a 8.33 b 8.44 c 8.83 c c a 8.42 b 8.90 b 9.85 b b a 9.01 a 9.78 a a a e 8.27 c 8.42 d 8.54 d 8.68 f 0.00 סיין חולי 15 d 8.38 bc 8.47 d 8.56 d 9.09 e c d 9.44 d b 8.52 b 8.83 c 8.92 c 9.78 c a 8.44 b 9.04 b 9.80 b b a 9.21 a 9.82 a a a c 8.29 c d 8.42 d 0.00 חרסית 0 c 8.35 c c 9.77 c 2.00 סילטית 30 b 9.12 b b b a a a a לא נמדד, כל תוצאה מייצגת ממוצע של 3 ניסויים, ב 4 חזרות כל ניסוי. ב 3 הקרקעות שנבחנו ריכוז האמון גופרתי היה 50 מ"ג אמון גופרתי/ 50 ג' קרקע. הביקורת נמדדה 4 ימים לאחר הרטבת הקרקע. מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי Tuckey-Kramer.P 0.05,HSD 1 33

41 טבלה 9: השפעת יישום בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס), אמון גופרתי ויישום משותף, על הדברת גופי קיימא של Verticillium dahliae, Sclerotium rolfsii,sclerotinia sclerotiorum ופרופגולים של F. oxysporum f. sp. dianthi (מחושב באחוזים) (%) הדברה ph טיפול F. o. f. sp.dianthi S.sclerotiorum S.rolfsii V.dahliae הקרקע 0 c 0 b 0 c 0 b 8.40 ביקורת 0 c 0 b 0 c 0 b 8.45 אמון גופרתי 35 b 0 b 20 b 0 b במ"ס 100 a 100 a 100 a 100 a במ"ס+אמון גופרתי כל תוצאה מייצגת ממוצע של 3 ניסויים, ב 4 חזרות כל ניסוי, לכל חזרה נבחנו חיוניות של 10 קישיונות או חלקי גבעול תפו"א. כמות הבמ"ס והאמון גופרתי היו: 2 ג'/ 50 ג' קרקע ו - 50 מ"ג /50 ג' קרקע בהתאמה. ה ph נמדד לאחר 4 ימי הדגרה. מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה על פי 0.05 P.,Tuckey-Kramer HSD מזה באופן מובהק, השפעת במ"ס וחנקן אמוניקאלי על החיוניות של.F, oxysporum.f sp. dianthi Verticillium dahliae ו - solani Rhizoctonia בגידול תפו"א במכלים בניסויי המעבדה בדקנו את השפעת התוספים השונים (במ"ס ואמון גופרתי) על ph תמיסת הקרקע ועל חיוניות הפתוגנים באותם קרקעות. על מנת לבחון את השפעת התוספים על הגורם הצמחי, בוצע ניסוי במכלי גידול בשטח פתוח, שצמח המבחן היה תפו"א. יישום התוספים היה בשכבה 0-20 ס"מ. חיוניות פוזריום: לאחר הצנעת התוספים (במ"ס ואמון גופרתי) מ, ארזים שהכילו קרקע בית דגן מאולחת טבעית ב - dianthi.f oxysporum.f sp. הוטמנו בשלושה עומקים למשך יום. הקרקע במארזים נבדקה לשם קביעת חיוניות הפרופגולים של.F oxysporum.f sp. dianthi (טבלה 10). ניתן לראות ששילוב של במ"ס עם ריכוזים שונים של חנקן אמוניקאלי הורידה בצורה מובהקת את מס' הפרופגולים בקרקע לעומת יישום של חנקן אמוניקאלי בלבד. הירידה המרבית בחיוניות הפוזריום בעומק 0-20 ס"מ הייתה כבר בריכוז חנקן אמוניקאלי של 62.5 מ"ג/ק"ג, אך בעומק הגדול יותר היא הושגה רק בריכוז האמוניום הגבוה. יתכן והייתה תנועה של אמוניה בפרופיל הקרקע, והדבר התבטא בהקטנה של חיוניות הפוזריום גם בעומק ס"מ. 34

42 ג/ ג/ ג/ ג/ טיפול טבלה 10: השפעת הוספת בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וריכוזים שונים של אמון גופרתי על רמת אוכלוסיית ה- ' CFU) F.oxysporum.f sp. dianthi קרקע) בקרקע כתלות של הזמן שחלף ממועד היישום ועומק הקרקע. במ"ס (טון/דונם) 1 במ"ס (אחוז) 10 ימים 14 ימים ' קרקע (עומק 0-10 ס"מ) 3 ימים CFU N-NH 4 "ג/ק"ג) מ( a a a b 15.7 b 17.0 b b 5.0 b 12.3 b b 0.0 b 0.0 b ' קרקע (עומק ס"מ) CFU a a a b b 237 b b 0.7 b 8 b b 0.0 b 0 b ' קרקע (עומק ס"מ) CFU 7499 a 6199 a a b 6813 a a ab 2359 b 5593 b c 0 c 70 c אחוז ממשקל הקרקע מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי Tuckey-.P 0.05,Kramer HSD חיוניות ריזוקטוניה וורטיציליום: מארזים עם פיסות גבעול תפו"א נגוע בגופי קיימא של ריזוקטוניה וורטיציליום הוטמנו מיד לאחר יישום התוספים בעומקים 0-10, ו ס"מ. המארזים הוצאו לאחר 14 יום, והחומר הצמחי הנגוע נלקח לשם הערכת החיוניות של כל פטרייה (סעיף 3.3.2), בהשוואה למארזים עם פיסות גבעול תפו"א נגוע בגופי קיימא של ריזוקטוניה וורטיציליום שלא הוטמנו בקרקע. בוורטיצליום הוספת חנקן אמוניקאלי בלבד הפחיתה את מס' הפרופגולים ב 25-30%, הוספת במ"ס ורמה נמוכה של חנקן אמוניקאלי (62.5 מ"ג/ק"ג) לא הייתה שונה באופן מובהק מהוספת חנקן בלבד. הוספת במ"ס ורמה בינונית של חנקן אמוניקאלי (125 מ"ג/ק"ג) הפחיתה במידה ניכרת את חיוניות הפרופגולים, אם כי ההפחתה המובהקת הייתה רק בעומק של ס"מ. ההפחתה המובהקת והטובה ביותר התקבלה בשילוב בין במ"ס ורמה של 250 מ"ג/ק"ג חנקן אמוניקאלי (טבלה 11). בריזוקטוניה הוספת חנקן אמוניקאלי בשיעור של 250 מ"ג/ק"ג הפחיתה ב- 100% ו - 43% את חיוניות הפרופגולים בעומק של 0-10 ו ס"מ בהתאמה. שילוב של במ"ס וחנקן אמוניקאלי בשיעור של 62.5 מ"ג/ק"ג הפחית בצורה מובהקת את שיעור ההדברה בעומק 35

43 ס( ס( ג/ ג/ 0-10 ס"מ, בעומק ס"מ הייתה מגמה של שיפור בשיעור ההדברה אך לא היה הבדל מובהק לעומת הטיפול שהכיל חנקן בלבד. שילוב של במ"ס וחנקן אמוניקאלי בשיעור של 125 ו 250 מ"ג/ק"ג הביא הדברה מלאה (טבלה 11). טבלה 11: השפעת הוספת בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וריכוזים שונים של אמון גופרתי על חיוניות הפרופגולים של Rhizoctonia solani ו - dahliae Verticillium בקרקע, כתלות בעומק הקרקע מבוטא כאחוז מביקורת (הביקורת 100% חיוניות). מ( טיפול במ"ס במ"ס Verticillium dahliae N-NH 4 (אחוז מביקורת ( (טון/דונם) (אחוז) "ג/ק"ג) 0-10 (ס"מ) "מ) 70.8 ab 75.0 a a 75.9 a b 43.1 a c 2.6 b Rhizoctonia solani (אחוז מביקורת ( "מ) (ס"מ) 56.8 a 0.0 b a 12.0 a b 0.0 b b 0.0 b אחוז ממשקל הקרקע 1 מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי- Tuckey.P 0.05,Kramer HSD 1 חיוניות של כלל הפטריות בקרקע: מארזים עם 5 ג' קרקע בית דגן הונחו מיד לאחר ישום התוספים בעומק 0-10, ו ס"מ. לאחר 14 יום המארזים הוצאו, והקרקע נלקחה לשם הערכת מס' הפרופגולים כללי (סעיף 3.3.2) (טבלה 12). שילוב בין מנה קבועה של במ"ס (10 טון/דונם (4%)) וריכוזים עולים של חנקן אמוניקאלי הפחיתה את מספר הפרופגולים יחסית לטיפול שקיבל חנקן בלבד. שילוב במ"ס עם ריכוז חנקן של 125 ו 250 מ"ג/ק"ג הפחית באופן מובהק את מס' הפרופגולים יחסית לטיפול שקיבל חנקן בלבד. טבלה 12: השפעת הוספת בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וריכוזים שונים של אמון גופרתי על אוכלוסיית פטריות כללית בקרקע CFU) ' קרקע) כתלות בעומק הקרקע (ס"מ). טיפול במ"ס (טון/דונם) אחוז ממשקל הקרקע 1 במ"ס (אחוז) ' קרקע a 4113 b 1497 bc 610 c CFU a 3747 ab 1356 bc 492 c N-NH 4 מ( "ג/ק"ג) מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי Tuckey-Kramer.P 0.05 HSD 1 36

44 מדגמי קרקע מעומק של 0-10 ס"מ במועדי דיגום של 14 0, ו 28 ימים לאחר יישום התוספים, נלקחו לשם בדיקת מוליכות חשמלית,,pH N-NH 4 ו 3 N-NO בתמיסת הקרקע (סעיף.(3.3.2 מטבלה 13 ניתן לראות ש 10 טון/דונם במ"ס (4%) העלתה את המוליכות החשמלית ו - ph תמיסת הקרקע גם לאחר 28 ימים מיישום התוספים בקרקע, יחסית לתוספת חנקן בלבד (טיפול 1). לעומת זאת הוספת במ"ס מקטינה באופן דרסטי את ריכוזי החנקן האמוניקאלי בזמן אפס ו 14 יום לאחר היישום, יחסית לתוספת חנקן בלבד (טיפול 1). עשרים ושמונה ימים לאחר היישום אין הבדל משמעותי בין הטיפולים. טבלה 13: השפעת הוספת במ"ס וריכוזים שונים של אמון גופרתי על המוליכות החשמלית,,pH וריכוז החנקן האמוניקאלי בתמיסת הקרקע ביחס לזמן שחלף מיישום התוספים (הבדיקות על מדגמים מעומק 10-0 ס"מ). מ( 1 טיפול במ"ס במ"ס N-NH 4 מוליכות חשמלית (ds/m) (טון/דונם) (אחוז) "ג/ק"ג) 0 ימים 14 ימים 28 ימים 1.3b - 4.4a a a a a a a ph 28 ימים 14 ימים 0 ימים 8.8b 8.5b 8.5b a 11.8a 11.4a a 11.7a 11.3a a 11.9a 11.3a ( mg/kg) N-NH 4 (N-NO 3 ) 2 28 ימים 14 ימים 0 ימים 1.2a(10.3) 28.3a 196.3a a (2.0) 1.6b 2.1b a (2.3) 0.9b 1.7b a (1.0) 0.7b 1.6b מוליכות חשמלית 1 במ"ס אחוז ממשקל הקרקע,אנליזה של הבמ"ס נתנה את התוצאות הבאות: (Ec) N-NH 4,11.8 ph, ds/m מ "ג/ק"ג, N-NO 3 6 מ "ג/ק"ג, גיר (%) מספר בסוגרים, ריכוז חנקן חנקתי ) 3 (N-NO במ"ג/ק"ג. מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי Tuckey-.P 0.05,Kramer HSD - לא ניתן בסיום הניסוי נאסף יבול הפקעות מכל החזרות (3 צמחים לחזרה), מוין לפי מקטעי גודל ונשקל (איור 1). לא נמצא הבדל מובהק במקטעי הגודל <35mm) ו 35 45,(mm במקטע הגודל (>45mm) וכן בסה"כ יבול היה הבדל מובהק לטובת השילוב בין במ"ס (4%) ורמת חנקן אמוניקאלי (62.5 מ"ג /ק"ג) לעומת הטיפול שקיבל חנקן בלבד (250 מ"ג /ק"ג). 37

45 ג( משקל פקעות ) ג' ( b a ab ab b a ab ab 400 a a a a a a a a 0 <35 mm mm >45 mm Total גודל פקעות (מ"מ) במ"ס % מ"ג חנקן אמוניקאלי/ק"ג קרקע במ"ס % מ"ג חנקן אמוניקאלי/ק"ג קרקע במ"ס % מ"ג חנקן אמוניקאלי/ק"ג קרקע במ"ס % מ"ג חנקן אמוניקאלי/ק"ג קרקע איור 1: השפעת טיפול בקרקע בבוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) ובאמון גופרתי על יבול פקעות תפו"א ממוצע ') ב- 3 מקטעי גודל (קטן מ- 35 מ"מ, מ"מ, גדול מ 45 מ"מ) וסה"כ יבול ממוצע לטיפול. עמודות המלוות באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי,Tuckey-Kramer HSD.P 0.05 השפעת תוספי במ"ס וחנקן אמוניקאלי על.F oxysporum.f sp. dianthi שוכן קרקע בגידול ציפורן בוצעו שני ניסויי שדה במהלך 2 עונות גידול (1999/2000, 2000/2001) שבהם נבדקה השפעת יישום במ"ס וחנקן אמוניקאלי בקרקע בית דגן המאולחת טבעית ב- sp..f oxysporum.f dianthi על חיוניות הפטרייה בקרקע, בגידול ציפורן הרגיש לפטרייה. הניסוי הראשון (1999/2000) בוצע לשם קבלת אומדן ראשוני על השפעת השילוב במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הדברת הפטרייה בקרקע. בעקבות התוצאות שהתקבלו בוצע הניסוי השני (2000/2001) שבו מספר השילובים בין במ"ס וריכוז החנקן האמוניקאלי היה גדול יותר ובו גם שולב טיפול שבא לבחון הוספת בוצה. בעונת הניסוי 1999/2000, הוספת במ"ס וחנקן אמוניקאלי לקרקע הפחיתה את מס' הפרופגולים של.F oxysporum.f sp. dianthi בקרקע בהשוואה לטיפול הביקורת (ללא תוספים), אבל ההבדל היה מובהק רק בדיגום הראשון (25 יום לאחר יישום החומרים). בהמשך המגמה נותרה בעינה אבל היא לא הייתה מובהקת (איור 2). 38

46 30000 a F. oxysporum f. sp. dianthi (CFU) a b a a a ימים לאחר יישום התוספים במ "ס 10 טון/דונם + 72 ק"ג חנקן אמוניקאלי/דונם בקורת איור 2: השפעת הוספת 10 טון/דונם בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וחנקן אמוניקאלי בשיעור של 72 ק"ג/דונם, על הדברת.F oxysporum.f sp. dianthi (מחושב כ- CFU /גר' קרקע), בקרקע בית דגן, בגידול ציפורן, 1999/2000. עמודות המלוות באותה אות אינם נבדלות זו מזו באופן מובהק, על פי 0.05 P.,Tuckey-Kramer HSD בסיום עונת הגידול הצמחים נאספו בהתאם לטיפולים ונעשה כימות של איכות הצמחים והענפים (סעיף 3.3.3), מניתוח הנתונים בטבלה מס' 14 ניתן לראות שכמות הצמחים המתים והחולים (מס' ואחוז) וכן באחוז הענפים החולים, שהביקורת הייתה גבוהה באופן מובהק לעומת הטיפול שקיבל תוספת של במ"ס וחנקן אמוניקאלי. המשקל הממוצע של צמח בריא או חולה היה גבוה בצורה מובהקת בטיפול הבמ"ס וחנקן אמוניקאלי לעומת טיפול הביקורת. 39

47 טבלה 14: השפעת הוספת 10 טון/דונם בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וחנקן אמוניקאלי בשיעור של 72 ק"ג/דונם, על הנגיעות ב - dianthi.f oxysporum.f sp. בצמחי ציפורן (מספר, אחוז ומשקל), 1999/2000. טיפול פרמטר במ"ס + 4 N-NH ביקורת 17.6 a 5.2 a מס ' צמחים בריאים 0.4 b 3.9 a מס' צמחים מתים 13.9 b 21.1 a מס' צמחים חולים 45.0 b 82.0 a אחוז צמחים חולים 18.6 b 48.3 a אחוז ענפים חולים מכלל הענפים 4.6 b 0.86 b משקל צמחים בריאים (ק"ג) 2.3 a 2.5 a משקל צמחים חולים (ק"ג) a b משקל ממוצע בריא (ג') a b משקל ממוצע חולה (ג') כל טיפול, ממוצע של 8 חזרות. שורות המלוות באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי 0.05 P.,Tuckey-Kramer HSD בעונה השניה (2000/2001 ה) קרקע נדגמה לעומק 60 ס"מ להערכת מס' הפרופגולים של (CFU) מציג את מס' הפרופגולים 3A.(3.3.3 איור (סעיף F. oxysporum f. sp. dianthi בעומק 0-20 ס"מ. החל מ 5 ימים לאחר יישום הבמ"ס ושיעורי החנקן האמוניקאלי השונים ועד לסיום הניסוי (250 יום לאחר היישום) היתה הפחתה מובהקת במס' הפרופגולים בכל הטיפולים ששילבו במ"ס וחנקן בהשוואה לטיפולי הביקורת והבוצה. בטיפול שקיבל במ"ס בלבד היתה הפחתה מובהקת במס' הפרופגולים רק ב 2 מועדי דיגום: 50 ו 250 יום לאחר יישום החומרים. באיור 3B הושוו 2 טיפולים: ביקורת וטיפול במ"ס (7.5 טון/דונם) וחנקן אמוניקאלי (72 ק"ג/דונם = 250 מ"ג/ק"ג) ב 4 מועדי דיגום, לפני היישום וזמן קצר לאחר היישום (5 ימים) לא היה הבדל מובהק בין 2 הטיפולים, אבל ככל שזמן הדיגום היה רחוק יותר ממועד יישום החומרים (50 120, ו 250 יום) קיבלנו הפחתה מובהקת במס' הפרופגולים לטובת הטיפול המשולב של במ"ס וחנקן. באיור 3C הושוו שוב הטיפולים מאיור 3B ב 2 תאריכי דיגום בלבד ונמצא שהוספת במ"ס וחנקן הורידה באופן מובהק את מס' הפרופגולים לעומת הביקורת, 5 ימים לאחר יישום החומרים. 40

48 F. oxysporum f. sp. dianthi (CFU) A 0-20 cm a a a a a a ab ab b b b a b b b b a ימים לאחר יישום התוספים a ab b b b a a ab ab bcc c a bc c c c ab במ "ס, 7.5 טון לדונם בקורת N-NH4 לדונם N-NH4 לדונם במ"ס, 7.5 טון לדונם + 18 ק"ג במ"ס, 7.5 טון לדונם + 72 ק"ג במ "ס, 7.5 טון לדונם + 36 ק"ג N-NH4 לדונם בוצה F. oxysporum f. sp. dianthi (CFU) B cm a a a a a b a b a b ימים לאחר יישום התוספים במ "ס, 7.5 טון לדונם + 72 ק"ג N-NH4 לדונם בקורת 600 c cm a a F. oxysporum f. sp. dianthi (CFU) b b ימים לאחר יישום התוספים במ "ס, 10 טון לדונם + 72 ק"ג N-NH4 לדונם בקורת איור 3: השוואה בין הוספת 7.5 טון/דונם בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וחנקן אמוניקאלי בשיעור של 18, 0, 36 ו 72 ק"ג/דונם לבין טיפול ביקורת (ללא תוספים), וטיפול הוספת בוצה בלבד בשיעור של 5.5 טון לדונם, לגבי מס' הפרופגולים של.F oxysporum.f sp. dianthi בקרקע בית דגן,(CFU) - A עומק 0-20 ס"מ, - B עומק ס"מ, -C עומק ס"מ, בגידול ציפורן 2000/2001. עמודות המלווות באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי Tuckey-.P 0.05,Kramer HSD בסיום עונת הגידול הצמחים נאספו בכל אחד מהטיפולים ונעשה כימות של איכות הצמחים והענפים (סעיף 3.3.3) (טבלה 15), ניתן לראות כי: 41

49 א( ג( ב( א( ד( ד( ג( ב( ). משקל הצמחים הבריאים בכל טיפולי התוספים היה גבוה באופן מובהק סטטיסטית בהשוואה לביקורת, טיפול 6 (במ"ס + ריכוז אמון גבוה) היה גבוה באופן מובהק מכל הטיפולים למעט טיפול 5 (במ"ס + ריכוז אמון בינוני). ). מס' הצמחים הבריאים בכל טיפולי התוספים היה גבוה באופן מובהק בהשוואה לביקורת. לא היה הבדל מובהק בין טיפולי הבמ"ס + חנקן אמוניקאלי, טיפולים 5 ו 6 (במ"ס + ריכוז אמון בינוני וגבוה בהתאמה) היו גבוהים יותר באופן מובהק מטיפול 3 (בוצה) ). מס' הצמחים החולים בכל טיפולי הבמ"ס היה נמוך באופן מובהק מטיפול הביקורת. משקל צמח בריא טיפול 3 (בוצה) וטיפול ומטיפול 4 (במ"ס + ריכוז אמון נמוך). טיפול.( 6 (במ"ס + ריכוז אמון גבוה) היו גבוהים מהביקורת טבלה 15: השפעת יישום בוצה, בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וחנקן אמוניקאלי על הנגיעות ב - dianthi F. oxysporum f. sp. בצמחי ציפורן (מספר, משקל).2000/2001 טון במ"ס לדונם ק"ג N-NH 4 לדונם 1 בוצה משקל צמחים בריאים (ק"ג) 0.13c 0.55b 0.59b 0.55b 0.91ab 1.20a מס' צמחים בריאים מס' צמחים חולים 14.1a 1.5d bc 4.6bc ab 3.9c bc 5.4abc bc 6.9ab c 7.4a מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי.P 0.05,Kramer HSD 1 בוצה שניונית בריכוז של 5.4 טון לדונם. - לא ניתן המשך סיכום הנתונים הצמחיים מופיע בטבלה 16. משקל צמח בריא (ג') 88.3b 114.1ab 149.4a 103.8b 129.7ab 153.7a Tuckey- ). ניתן עוד לראות, כי אחוז משקל צמחים חולים מסה"כ כל טיפולי התוספים היה נמוך באופן מובהק מהביקורת, טיפול 6 (במ"ס + ריכוז אמון גבוה) היה נמוך מובהק מכל שאר הטיפולים למעט טיפול 5 (במ"ס + ריכוז אמון בינוני)..( אחוז צמחים חולים מסה"כ כל טיפולי הבמ"ס היה נמוך באופן מובהק מהביקורת, טיפולים 5 ו - 6 (במ"ס + ריכוז אמון בינוני וגבוה בהתאמה) היה נמוך באופן מובהק גם מטיפול 3 (בוצה). ). מס' פרחים בצמחים בריאים בטיפול 2 (במ"ס בלבד) וכן בטיפולים 5 ו - 6 (במ"ס + ריכוז אמון בינוני וגבוה בהתאמה) ה הי (בוצה) גבוה בצורה מובהקת מהביקורת. היה גבוה באופן מובהק מכל הטיפולים האחרים. ). מס' פרחים בצמחים חולים בטיפול 3 42

50 ב( א( ג( ד( ה ו טיפול טבלה 16: השפעת יישום בוצה, בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וחנקן אמוניקאלי על הנגיעות ב -.F oxysporum.f sp. dianthi בצמחים ובפרחים של ציפורן (אחוז, מספר) 2000/2001. טון במ"ס לדונם ק"ג N-NH 4 לדונם 1 בוצה אחוז משקל חולים מסה"כ 90.4 a 68.3 bc 76.4 ab 66.1 bc 50.8 cd 47.2 d אחוז צמחים חולים מסה"כ 90.5 a 69.3 bc 77.0 ab 64.2 bc 53.0 c 51.2 c מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק,.P 0.05,HSD 1. בוצה שניונית בריכוז של 5.4 טון לדונם. - לא ניתן מס' פרחים בצמחים בריאים 10.6 b 55.6 a 46.3 ab 36.1 ab 56.7 a 73.1 a על פי מס' פרחים בצמחים חולים 69.2 b 74.6 b a 70.3 b 58.6 b 50.3 b Tuckey-Kramer מניתוח הפרמטרים של היבול הצמחי ניתן להצביע על מספר היבטים. יש למעשה 3 טיפולים שניתן להתייחס אליהם כביקורת: טיפול 1 0 תוספים, טיפול טון במ"ס/ד', טיפול טון בוצה/ד', כאשר משווים בין הטיפולים השונים. ). מס' ומשקל צמחים בריאים (טבלה 15) בטיפול 1 יש פחיתה מובהקת לעומת שאר הטיפולים (היבט של מחסור בהזנה חנקתית), ועליה מובהקת בטיפול הבמ"ס + 72 ק"ג/ד' חנקן לעומת טיפולי 3 2, ובמ"ס + 18 ק"ג/ד' חנקן (היבט של הדברה). ). מס' צמחים חולים (טבלה 15) טיפולי הבמ"ס עם או בלי תוספת חנקן אמוניקאלי היו פחותים בצורה מובהקת מטיפול 1 (השפעה של ה ph וריכוז האמוניה), טיפול הבוצה היה גבוה במובהק מטיפול הבמ"ס + 72 ק"ג/ד' חנקן אבל לא היה שונה במובהק מכל הטיפולים האחרים (השפעה של ריכוז האמוניה). ). מס' פרחים בצמחים בריאים (טבלה 16) טיפול 2 (במ"ס בלבד) וטיפולי הבמ"ס עם 36 ו 72 ק"ג חנקן היו גבוהים באופן מובהק לעומת הטיפול 1 (השפעה של ה ph בטיפול 2 והשפעה של ה ph וריכוז האמוניה ב 2 טיפולי הבמ"ס + חנקן). ). מס' פרחים בצמחים חולים (טבלה 16) טיפול הבוצה היה גבוה בצורה מובהקת לעומת שאר הטיפולים (הזנה חנקתית עודפת). השפעת הטיפולים על מדדים כימיים בקרקע נבחנה מיד לאחר הטיפול ו - 5, 26 ו 120 ימים לאחר יישום התוספים. מדגמי קרקע מעומק 0-20 ס"מ נלקחו ונבדקו:,pH במיצויי הקרקע (טבלה 17). N-NO 3 N-NH 4 43

51 טיפול טבלה 17: נתוני,pH חנקן אמוניקאלי ) 4 (N-NH וחנקן חנקתי ) 3 (N-NO של הקרקע ביחס לזמן מיישום התוספים השונים (בוצה, אמון גופרתי ובוצה מיוצבת בסיד (במ"ס)). ניסוי הדברת - dianthi F. oxysporum f. sp. בגידול ציפורן.2000/2001 ph 1 בוצה ק"ג N-NH 4 לדונם טון במ"ס לדונם ימים מיישום התוספים ab 8.4cd * 8.0b ab 11.7a * 12.1a b 8.3d * 8.3b a 11.4a * 12.0a ab 11.1ab * 12.0a b 9.8bc * 12.0a N-NH4 (מ"ג/ק"ג) 0.44ab 5.0b * 2.0c c 9.0b 19b 21.0c bc 41.0ab 90a 135.0ab c 38.0ab 8b 69.0bc ab 51.0ab 40b 59.0bc a 84.0a 21b 194.0a N-NO 3 (מ"ג/ק"ג) 0.2a 6.0b * 12.0a a 20.0ab 15a 17.0a a 48.0ab 30a 20.0a a 52.0a 21a 14.0a a 16.0ab 17a 10.0a a 1.0ab 9a 9.0a מוליכות חשמלית (Ec) N-,12.4 -ph, ds/m אנליזה של הבמ"ס נתנה את התוצאות הבאות: NH מ"ג/ק"ג, N-NO מ"ג/ק"ג, אשלגן 5889 מ"ג/ק"ג. 2 בוצה שניונית בכמות של 5.4 טון לדונם. מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי Tuckey-Kramer.P 0.05,HSD - לא ניתן * לא נבדק ניתן לראות כלהלן: א). ph במועד היישום של התוספים, כל טיפולי הבמ"ס היו גבוהים באופן מובהק לעומת הביקורת וטיפול הבוצה. 26 ימים לאחר היישום, עדיין היו מרבית טיפולי הבמ"ס גבוהים לעומת טיפולי הביקורת והבוצה. לאחר 120 יום מהיישום, ה ph היה דומה מאוד בכל הטיפולים. ב). - N-NH 4 בזמן אפס, רמת החנקן האמוניקאלי הייתה גבוהה באופן מובהק בטיפול הבוצה ובטיפול מספר 6 (במ"ס + ריכוז אמון גבוה). לאחר 5 ימים, טיפול הבוצה היה עדיין גבוה באופן 44

52 מובהק לעומת טיפולי הבמ"ס. לאחר 26 ימים, טיפול 6 (במ"ס + ריכוז אמון גבוה) היה גבוה באופן מובהק לעומת הביקורת וטיפול 2 (במ"ס בלבד). לאחר 120 יום הרמות ירדו בצורה דרסטית בכל הטיפולים, אם כי היה הבדל מובהק בין חלק מהטיפולים. ג). N-NO 3 לא נמצאו הבדלים מובהקים בין הטיפולים. השפעת במ"ס, CKD (אבק כבשני מלט) וחנקן אמוניקאלי על הדברת Verticillium dahliae ו - solani Rhizoctonia בגידול תפו"א בסתיו 2000 בוצע ניסוי שדה שבו נבדקה השפעת יישום במ"ס, CKD וחנקן אמוניקאלי בקרקע גילת המאולחת טבעית ב-.V dahliae וב solani.r בגידול תפו"א. השימוש ב CKD היה לצורך העלאת ה ph של הקרקע לרמה הרצוייה, הואיל והבמ"ס לא היה בסיסי דיו. על מנת לרדת בכמות הבמ"ס וה CKD הדרוש להעלאת ה,pH בטיפול נוסף הכפלנו את ריכוז החנקן האמוניקאלי בקרקע. טבלה 18 מסכמת את הנתונים הכימיים של הקרקע לפי הפירוט הבא: א). ph במועד היישום של התוספים, כל טיפולי הבמ"ס + CKD היו גבוהים באופן מובהק לעומת טיפולים 4 ו 5 (ביקורת ובוצה בהתאמה). הטיפולים שהכילו את רמת ה CKD הגבוהה (1 ו 3) היו גבוהים באופן מובהק מטיפול 6 (במ"ס + ריכוז חנקן גבוה). בתאריכי הדיגום הבאים לא היה הבדל מובהק בין הטיפולים. ב). מוליכות חשמלית באופן כללי כל הטיפולים שהכילו במ"ס היו גבוהים באופן מובהק מטיפולים 4 ו 5 (ביקורת ובוצה בהתאמה), ג). N-NH 4 בזמן אפס, טיפול 6 (במ"ס + ריכוז חנקן גבוה) היה גבוה באופן מובהק מכל הטיפולים האחרים למעט טיפול 5 (בוצה). 21 יום לאחר מכן טיפול 6 (במ"ס + ריכוז חנקן גבוה) היה גבוה באופן מובהק מטיפול 4 (ביקורת) ומטיפול 1, טיפול 5 (בוצה) היה גבוה באופן מובהק מטיפול 4 (ביקורת). 40 יום לאחר היישום טיפול 6 (במ"ס+ ריכוז חנקן גבוה) היה גבוה באופן מובהק מכל הטיפולים האחרים. 82 יום לאחר היישום לא היה הבדל מובהק בין הטיפולים. ג). N-NH 4 בזמן אפס, טיפול 6 (במ"ס + ריכוז חנקן גבוה) היה גבוה באופן מובהק מכל הטיפולים האחרים למעט טיפול 5 (בוצה). 21 יום לאחר מכן טיפול 6 (במ"ס + ריכוז חנקן גבוה) היה גבוה באופן מובהק מטיפול 4 (ביקורת) ומטיפול 1, טיפול 5 (בוצה) היה גבוה באופן מובהק מטיפול 4 (ביקורת). 40 יום לאחר היישום טיפול 6 (במ"ס+ ריכוז חנקן גבוה) היה גבוה באופן מובהק מכל הטיפולים האחרים. 82 יום לאחר היישום לא היה הבדל מובהק בין הטיפולים. 45

53 מ( טיפול טבלה :18 נתוני,pH מוליכות חשמלית,(EC) חנקן אמוניקאלי ) 4 (N-NH וחנקן חנקתי ) 3 (N-NO של הקרקע ביחס לזמן מיישום התוספים השונים (בוצה, אבק כבשני מלט,(CKD) אמון גופרתי ובוצה מיוצבת בסיד (במ"ס)). ניסוי תפו"א, גילת 2000/ a 1.5ab 1.5ab 0.3c 0.4bc 2.0a CKD 2 (טון לדונם) 1 במ"ס (טון לדונם) 3 בוצה (טון לדונם) ימים מיישום התוספים ph 8.6a 8.8a 8.0a 8.5a 8.0a 8.8a 7.9a 8.2a 7.6a 8.2a 7.7a 8.3a מוליכות חשמלית (Ec) ds/m 5.6a 5.7a 4.1a 3.9b 4.0a 4.0b 1.3b 1.1c 1.5b 1.5c 3.8a 5.0ab a 10.0ab 10.7a 8.3c 8.3c 8.6bc 6.7a 4.9a 6.0a 1.1b 1.1b 5.6a N-NH 4 "ג לק"ג) a 10.0a 3.0a 2.0a 5.0a 3.0a N-NH 4 (מ"ג/ק"ג) 233.0b 193.0b c 280.0b 310.0abc 382.0b 262.0abc 91.0b 172.0c 262.0b 582.0ab 792.0a 602.0a 106.0b 402.0b 406.0b 461.0b 725.0ab a N-NO 3 (מ"ג/ק"ג) 31.0ab 11a 40c 17a a 15a 53bc 22a ab 29a 51c 6a b 63a 139a 19a b 46a 116ab 106a ab 85a 26c 27a אנליזה של הבמ"ס נתנה את התוצאות הבאות: מוליכות חשמלית (Ec) -N 10.5, -ph 2.9, ds/m NH מ"ג/ק"ג, N-NO מ"ג/ק"ג. 2 אנליזה של הבוצה (שניונית) נתנה את התוצאות הבאות: מוליכות חשמלית (Ec) ph 5.4, ds/m N-NH 4, מ"ג/ק"ג, N-NO מ"ג/ק"ג. מוליכות חשמלית (Ec) N-,12.4 ph,69 ds/m 3 אנליזה של ה - CKD נתנה את התוצאות הבאות: NH מ"ג/ק"ג, - N כללי 246 מ"ג/ק"ג. על פי Tuckey-Kramer מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק,.P 0.05,HSD - לא נבדק 46

54 מ( מ( ב( ד). - N-NO 3 בזמן אפס, לא היה הבדל מובהק בין הטיפולים, 21 יום לאחר מכן טיפול 4 (ביקורת) היה גבוה באופן מובהק מכל הטיפולים האחרים למעט טיפול 5 (בוצה), טיפול הבוצה היה גבוה באופן מובהק מטיפולים 3 1, ו יום לאחר היישום לא היה הבדל מובהק בין הטיפולים. 82 יום לאחר היישום טיפול 2 היה גבוה באופן מובהק מטיפול 4 ו יום לאחר הזריעה, נדגמו 10 גבעולים מכל חזרה ונבדקה הנגיעות ב dahliae.v (טבלה 19). לא היה הבדל מובהק באחוז הגבעולים הנגועים בין הטיפולים השונים, אבל מס' המושבות (רמת האינוקולום) מטיפולים 2 ו.3 טיפול בטיפולים 4 ו - 5 יקורת ובוצה בהתאמה) היה גבוה באופן מובהק טבלה 19: השפעת יישום בוצה, בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס), חנקן אמוניקאלי ואבק כבשני מלט (CKD) על הנגיעות ב - dahliae Verticillium בגבעולי תפו"א (אחוז גבעולים נגועים ומס' מושבות ממוצע) בניסוי תפו"א, גילת 2000/2001. % גבעולים בוצה CKD במ"ס N-NH 4 נגועים (טון (טון (טון "ג לדונם) לדונם) לדונם) לק"ג) 22a a a a a a מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי.P 0.05,Tuckey-Kramer HSD מס' מושבות (CFU) 4.1ab 7.5b 6.3b 224.6a 211.6ab 20.4ab בסיום הגידול נאספו הפקעות מכל החזרות ומוינו על פי מקטעי גודל. טבלה 20 מסכמת את יבול הפקעות הממוצע על פי התפלגות גדלים וסה"כ יבול. טיפול טבלה 20: השפעת יישום בוצה, בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) וחנקן אמוניקאלי ואבק כבשני מלט (CKD) על משקל פקעות ממוצע (ק"ג/דונם) לפי מקטעי גודל (מ"מ) וסה"כ יבול ממוצע לדונם. יבול פקעות ק"ג/דונם בוצה CKD במ"ס N-NH 4 סה"כ 55< mm > mm (טון (טון (טון "ג mm לדונם) לדונם) לדונם) לק"ג) 3073a 1000a 1908b 165ab a 852a 2148ab 220ab a 926a 2408ab 194ab a 741a 3130a 261ab a 1184a 3148ab 341a a 1185a 2371ab 137b מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי Tuckey-Kramer.P 0.05,HSD 47

55 מ( מקטע 35> mm טיפול במ"ס +חנקן גבוה היה נמוך באופן מובהק משאר הטיפולים, מקטע mm טיפול הביקורת (4) היה גבוה באופן מובהק מטיפול 1, מקטע 55< mm לא היו הבדלים בין הטיפולים, סה"כ יבול לא היו הבדלים מובהקים בין הטיפולים. טיפול מהיבול של כל חזרה נדגמו 50 פקעות לשם הערכת הנגיעות בריזוקטוניה ובכתמי כסף. מטבלה 21 ניתן לראות שלא היה הבדל מובהק ברמת כתמי הכסף בין כל הטיפולים. אחוז הנגיעות בריזוקטוניה היה גבוה באופן מובהק בטיפול 4 (ביקורת) לעומת הטיפולים האחרים למעט טיפול 5 (בוצה). טבלה 21: השפעת יישום בוצה, בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס), חנקן אמוניקאלי ואבק כבשני מלט (CKD) על נגיעות בריזוקטוניה ובכתמי כסף בפקעות (אחוז פקעות נגועות) בניסוי תפו"א, גילת 2000/2001. % נגיעות בוצה CKD במ"ס N-NH 4 בריזוקטוניה (טון (טון (טון "ג לדונם) לדונם) לדונם) לק"ג) 2.3b b b a ab b מספרים באותו טור המלווים באותה אות אינם נבדלים זה מזה באופן מובהק, על פי.P 0.05,Tuckey-Kramer HSD % נגיעות בכתמי כסף 11.4a 11.4a 20.7a 21.4a 14.0a 15.7a השפעת ריכוז האמוניה, תכונות הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע ועל קבלת אמוניה גזית באווירת הקרקע. 4.2 היפותזת העבודה להסביר את ההבדל בדפוסי ההדברה בקרקעות השונות הייתה שתכונות הקרקע (כימיות ופיזיקאליות) משפיעות על ריכוז האמוניה בתמיסת ובאווירת הקרקע הזמינה להדברה. בחינת היפותזה זו התבצעה ע"י ניסיונות in vitro במעבדה. המשתנים שנבדקו היו: סוגי הקרקע (חול, חול סייני, סיין חולי, סיין חרסיתי חולי, חרסית), תכולת הרטיבות בקרקע, ph תמיסת הקרקע וריכוז כללי של אמוניה גזית. הניסויים בחנו את השפעת הגורמים לעיל על ריכוז האמוניה החופשי לאחר זמן מגע קבוע של 4 שעות. השפעת ריכוז אמוניה ומרקם הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע יבשה, ועל ריכוז האמוניה הגזית באווירת הקרקע נבדקה ספיחת אמוניה לקרקע יבשה (C 48 45, 0 שעות). איור 4 מתאר את אופי הספיחה בקרקעות שצוינו בטבלה 7, בתחום הריכוזים שנבדק (עד 40 מ"ג אמוניה/ליטר אוויר), ספיחת 48

56 האמוניה לקרקעות נתניה (A), נחל עוז (C), גילת (D) ו בית דגן (F) מאופיינת בעקום דמוי L (אפיניות גבוהה של הקרקע לאמוניה) שבו שיפוע הקו הולך ומתמתן ככל שריכוז האמוניה המוזרק עולה. ספיחת האמוניה לקרקע גולן (B) מתאפיינת בעקום דמוי L עם שיפוע יחסית אחיד בתחום הריכוזים שבו נבדק. ספיחת האמוניה לחול מראשל"צ (E) מתאפיינת בעקום דמוי H (אפיניות גבוהה של האמוניה לקרקע) שבו הספיחה מגיעה לרוויה בריכוז אמוניה נמוך וכתוצאה מכך שיפוע הקו מתאפס. אמוניה ספוחה (מ"ג/ק"ג קרקע) C E D F ריכוז אמוניה (מ"ג/ליטר) A B איור 4: ספיחת אמוניה לקרקע (מ"ג/ק"ג קרקע) כתלות בריכוז האמוניה המוזרקת (מ"ג/ליטר) במס' קרקעות (טבלה 7): A נתניה 8 (סיין חרסיתי חולי), B גולן 4 (חרסית), C נחל עוז (סיין חרסיתי חולי), D גילת (סיין חולי), E ראשל"צ (חול), F בית דגן (חול סייני). כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. 49

57 איור 5 וטבלה 22 מציגים את נתוני ספיחת האמוניה של 5 קרקעות כפי שחושבו על פי משוואת.Langmuir θ = X/X 0 [1] - θ החלק היחסי של האמוניה הספוח מכלל אתרי הספיחה לאמוניה ריכוז אמוניה ספוח מקסימאלי (מ"ג/ ק"ג קרקע) X 0 ריכוז אמוניה ספוח (מ"ג/ק"ג קרקע), - X θ = (K*C)/(1+K*C) [2] C ריכוז אמוניה גזית (מ"ג/ליטר אוויר), K קבוע שיווי המשקל [3] כאשר נציב במקום θ את X/X 0 נקבל X = (X O *K*C)/(1+K*C) [4] כאשר נציב משני המשוואה את ההופכי נקבל 1/X 1.4E E E E E E E E+00 1/X = (1/X O *K)*1/C + 1/X 0 מהצבת נתוני X/1 ביחס ל C/1 בקרקעות השונות קיבלנו נתונים המוצגים באיור מס' 5, שממנו קיבלנו את הנתונים בטבלה 22, כאשר X/1 0 K* הוא השיפוע של קו הרגרסיה ו 0 1/Xהוא נקודת A E E E E E E E E+00 החיתוך (0=X) E-03 C 3.0E-03 D 1.2E E E E E E E E E E E E E E E E E E E E+00 E E E E E E+00 איור 5: ההופכי לריכוז האמוניה הספוחה (X/1) כתלות בהופכי של ריכוז האמוניה המוזרקת (C/1) בקרקעות: נתניה (A 8 - סיין חרסיתי חולי), גולן (B 4 - חרסית), נחל עוז (C - סיין חרסיתי חולי), גילת (D - סיין חולי), בית דגן (E - חול סייני), ראשל"צ (F - חול). B F /C 50

58 טבלה 22: מדדי ספיחת אמוניה לקרקעות מחושבים מהטרנספורמציה הלינארית של משוואת לנגמואיר, בקרקעות: נתניה 8 (סיין חרסיתי חולי), גולן 4 (חרסית), נחל עוז (סיין חרסיתי חולי), גילת (סיין חולי), בית דגן (חול סייני). קרקע משוואת העקום R 2 גולן X+2* Y= נחל עוז X+2* Y= נתניה X+3* Y= גילת X+5* Y= בית דגן X+7* Y= ראשל"צ X Y= משוואות הרגרסיה הותאמו באמצעות תוכנת Excel X K השפעת ריכוז אמוניה, תכונות הקרקע ותכולת הרטיבות בקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע בדקנו את השפעת תכונות הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע, וריכוזי האמוניה על ספיחת האמוניה ועל תכולתו באוויר הקרקע (אמוניה שאריית). נבדקו 3 מצבי רטיבות: קרקע יבשה (C 48 45, 0 שעות), קרקע בתכולת רטיבות של קיבול שדה (F.C) וקרקע בתכולת רטיבות של 50% מים זמינים (מים זמינים = תכולת רטיבות בקיבול שדה תכולת רטיבות בנקודת כמישה). ניתן לראות (איור 6) כי במרבית הקרקעות שנבדקו ספיחת האמוניה עולה ככל שעולה תכולת הרטיבות בקרקע. יוצא דופן היתה קרקע גולן (B). בקרקע גולן ספיחת האמוניה לקרקע פחתה עם העליה בתכולת המים לקרקע. בחול דיונה מראשל"צ לא היה הבדל מהותי בתכולת האמוניה באוויר הקרקע בין 2 מצבי הרטיבות (קיבול שדה ו 50% מים זמינים) והבדל קטן יחסית ביניהם לבין קרקע יבשה. בקרקעות בית דגן (F) וגילת (D) לא היה הבדל משמעותי בתכולת האמוניה השאריתית בין 2 מצבי הרטיבות (קיבול שדה ו 50% מים זמינים), לעומת זאת היה הבדל ביניהם ובין הקרקע היבשה. בקרקעות נתניה (A) ונחל עוז (C) עלתה תכולת האמוניה השאריתית ככל שירדה תכולת הרטיבות בקרקע, אבל ההבדלים היו ניכרים רק בריכוזים הגבוהים יותר. 51

59 A Dry 50% F.C E 25 Dry C 50% F.C. Dry 50% F.C איור 6: ריכוז האמוניה הגזית השאריתי באוויר מעל הקרקע (מ"ג/ליטר) כתלות בריכוז האמוניה ההתחלתי באוויר (מ"ג/ליטר) וכתלות בתכולת הרטיבות בקרקע Dry) יבש, FC קיבול שדה, 50% מים זמינים) ובתכונות הקרקע (טבלה 7): A נתניה 8 (סיין חרסיתי חולי), B גולן 4 (חרסית), C נחל עוז (סיין חרסיתי חולי), D גילת (סיין חולי), E ראשל"צ (חול), F בית דגן (חול סייני). (כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן) ריכוז אמוניה התחלתי (מ"ג/ליטר) ריכוז אמוניה שאריתי באוויר הקרקע (מ"ג/ליטר) B 50% F.C Dry D Dry 50% F.C F Dry 50% F.C ph תמיסת השפעת ריכוז האמוניה, תכונות הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע ו הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע השפעת ph תמיסת הקרקע על ספיחת האמוניה לקרקע נבדקה לאחר התאמה של ph הקרקע באמצעות 2 תמיסות בעלות ph של 7 ו 10.3, ב 2 מצבי רטיבות קרקע (קיבול שדה ו - 50% מים זמינים), וב 4 סוגי קרקעות. על סמך איורים 7 ו 8 ניתן להתרשם שב 2 מצבי רטיבות 52

60 הקרקע ובכל סוגי הקרקעות לא היה הבדל משמעותי ברמת האמוניה השאריתי באוויר הקרקע בין 2 רמות ה.pH ריכוז אמוניה התחלתי (מ"ג/ליטר) ריכוז אמוניה שאריתי באוויר הקרקע (מ"ג/ליטר) A C D B איור 7: ריכוז האמוניה הגזית באוויר הקרקע (מ"ג/ליטר) כתלות בריכוז האמוניה המוזרק (מ"ג/ליטר) וכתלות ב - ph תמיסת הקרקע בתכולת רטיבות של 50% מים זמינים במס' קרקעות (טבלה 7): A נתניה 8 (סיין חרסיתי חולי), B גולן 4 (חרסית), C נחל עוז (סיין חרסיתי חולי), D ראשל"צ (חול). (כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן). הקשר בין קק"ח הקרקע (טבלה 5) לבין ריכוז האמוניה השאריתי באוויר הקרקע היה אקספוננציאלי יורד (איור 9). ככל שהקק"ח היה גבוה יותר תכולת האמוניה באוויר הקרקע הייתה נמוכה יותר. כך בריכוז אמוניה התחלתי של 16.2 מ"ג/ליטר נותרו: ראשל"צ (1.6 מא"ק/ 100 ג'),93% בית דגן 8.1) מא"ק/ 100 ג'),69% גילת 13.2) מא"ק/ 100 ג'),55% נתניה 7.6) 8 מא"ק/ 100 ג') 41%, נחל עוז (21.9 מא"ק/ 100 ג') 28%, גולן ( מא"ק/ 100 ג') 3% מהכמות שהוזרקה לקרקע. 53

61 ריכוז אמוניה שאריתי באוויר הקרקע (מ"ג/ליטר) A C B D ריכוז אמוניה התחלתי (מ"ג/ליטר) איור 8: ריכוז האמוניה הגזית באוויר הקרקע (מ"ג/ליטר) כתלות בריכוז האמוניה המוזרק (מ"ג/ליטר) וכתלות ב - ph תמיסת הקרקע בתכולת רטיבות של קיבול שדה במס' קרקעות (טבלה 7): A D C 4 B נתניה 8 (סיין חרסיתי חולי), גולן (חרסית), נחל עוז (סיין חרסיתי חולי), ראשל"צ (חול). (כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן). נתוני טבלה מס' 23 מהווים המחשה לפוטנציאל נידוף של אמוניה מהקרקע (הדמיה של קרקע מכוסה בפוליאתילן אטום לאמוניה). במידה שהכלים פתוחים לאטמוספרה (קרקע חשופה), שיעור הנידוף יהיה גבוה יותר ב 3 הקרקעות הקלות-בינוניות (חול, חול סייני וסיין חולי) בגלל הספיחה החלשה יחסית (איור 4). 54

62 קק"ח (מא"ק/ 100 ג') בית דגן - חול סייני גילת - סיין חולי ראשל"צ - חול איור 9: ריכוז האמוניה באוויר הקרקע כתלות בקק"ח הקרקע (ריכוז אמוניה התחלתי של 16.2 מ"ג/ל'). טבלה 23: ריכוז אמוניה שאריתי (מ"ג/ל') בכלים אטומים ביחס לסוג הקרקע ותכולת הרטיבות בקרקע לאחר חשיפה לאמוניה. פוטנציאל נידוף (%) תכולת רטיבות ק"ג חנקן צרוף לדונם ריכוז אמוניה מרקם הקרקע קרקע קיבול שדה 50% מים יבש (עומק 15 מוזרק זמינים ס"מ) "ג/ל') 50.0 ± ± ± חול ראשל"צ חול סייני בית דגן 27.1 ± ± ± ± ± ± סיין חולי גילת 20.2 ± ± ± ± ± ± סיין נתניה ± ± ± חרסיתי חולי 6.7 ± ± סיין נחל עוז 13.2 ± ± ± חרסיתי חולי 2.6 ± ± חרסית גולן ± ± ± מספרים מודגשים חישוב לפי נוסחה, לא נמדד ישירות. אמוניה באוויר הקרקע (מ"ג/ליטר) נתניה - 8 סיין חרסיתי חולי נחל עוז - סיין חרסיתי חולי גולן - 4 חרסית 55

63 ל/ השפעת ריכוזי האמוניה וזמני החשיפה על הישרדות הפתוגנים ) in.(vitro 4.3 בדקנו את הרגישות של פטריות פתוגניות שוכנות קרקע לאמוניה, בניסויים in vitro במעבדה. המשתנים שנבדקו היו: ריכוז אמוניה וזמן חשיפה. בדקנו את ההשפעה על צורות חיים שונות: תפטיר (הפטריות (F. o. f. sp. lycopersici,r. solani,v. dahliae,s. rolfsii וגופי קיימא ) S.(F. o. f..sp. lycopersici - ו V. dahliae,.rolfsii השפעת ריכוז אמוניה וזמן חשיפה על הישרדות תפטיר של,Sclerotium rolfsii,fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,rhizoctonia solani ו -.Verticillium dahliae כל שילוב של פטרייה, ריכוז אמוניה וזמן חשיפה בוצע ב 2 מהלכים, ניסוי הקדמי לקביעת תחום הריכוזים המתאים, ולאחר מכן בדיקת התחום הרלוונטי באופן מפורט. כזכור (סעיף 3.5.1), לאחר החשיפה לאמוניה, דיסקיות הנושאות את הפטריה הודגרו במשך מספר ימים לבדיקת חיוניות הפטריה. זמן ההדגרה בימים כפי שמופיע בציור 10 היה: (A) Fusarium oxysporum.f - Verticillium dahliae (C) ימים, 3, Rhizoctonia solani (B) ימים, 7 sp. Lycopersici 10 ימים, (D).Sclerotium rolfsii - 4 ימים. הביקורת מצוינת בכל העקומות על ציר ה y 0) התפתחות שטח המושבה ללא חשיפה לאמוניה). המגמה הכללית כפי שמתבטאת באיור 10 היא שככל שעולים בזמן החשיפה ו/או בריכוז האמוניה שטח המושבה קטן, בזמני חשיפה קצרים ובריכוזי אמוניה נמוכים שטח המושבה משתווה או עולה על הביקורת (D, 5 דקות, 0.24 מ"ג/ל'). העלאת זמן החשיפה לאמוניה (ריכוז 4.8 מ"ג /ל') בתפטיר של - sp. Fusarium oxysporum.f lycopersici גרם לדחיית תחילת הצמיחה של התפטיר ביומיים לאחר חשיפה לפרקי זמן של 10 ו 20 דקות, ול 4 ימים אחרי חשיפה לפרק זמן של 30 דקות בהשוואה לביקורת ללא אמוניה (איור.(11 בשתי הפטריות Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (ריכוז אמוניה 4.8 מ"ג ') ו - solani Rhizoctonia (ריכוז אמוניה 6.8 מ"ג /ל') הייתה ירידה בשטח המושבה ככל שזמן החשיפה עלה (איור 11). 56

64 זמן חשיפה (דקות) איור 10: השפעת ריכוזי אמוניה (מ"ג / NH 3 ליטר אוויר) ומשכי חשיפה (דקות) על שטח מושבה ממוצע של 4 הפטריות:,Rhizoctonia solani - B,Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici - A. Sclerotium rolfsii - D,Verticillium dahliae - C משך הגידול לאחר החשיפה לאמוניה היה בהתאמה, 7 ימים, 3 ימים, 10 ימים ו 4 ימים. כל טיפול בוצע ב 6 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. שטח מושבה (ס"מ 2 ( A C B D זמן לאחר חשיפה (ימים) שטח מושבה (ס"מ 2 ( A B איור 11: השפעת משך החשיפה לאמוניה (דקות) על עיתוי ראשית צמיחת המושבה ועל שטחה ביחס לזמן שעבר מסיום החשיפה לריכוז קבוע של אמוניה, Fusarium oxysporum.f sp. - A - lycopersici 4.8 מ"ג NH 3 לליטר אוויר. Rhizoctonia solani - B 6.8 מ"ג NH 3 לליטר אוויר. 6 חזרות לכל טיפול, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. 57

65 הרצה משולבת של נתוני ריכוזי האמוניה, זמני החשיפה והשפעתם על יעילות ההדברה של כל פטרייה במבחן הרגרסיה המתאים הביא ליצירת משוואות הרגרסיה המופיעות בטבלה 24. טבלה 24: טבלת נתוני הרגרסיה של יעילות ההדברה (Y) בפטריות הבאות: Sclerotium rolfsii,verticillium dahliae,fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו - solani.rhizoctonia משוואת הרגרסיה פטרייה P-value* R 2 adj X T =0.003 X C =5*10-5 X T =0.03 X C =3.9*10-11 X T =6.9*10-4 X C =5.8*10-10 X T = 2.7* Y = T+9.0C Y = T+5.2C Y = T+65.3C Y = T+3.2C F. o. f. sp. lycopersici Verticillium dahliae Sclerotium rolfsii Rhizoctonia solani X C =2.1*10-6 אמוניה) (ריכוז C חשיפה), (זמן T - - משוואות הרגרסיה הותאמו באמצעות תוכנת Excel ממשוואת הרגרסיה בטבלה 24 הופקו העקומים שמופיעים באיור 12, המשלבים את השפעת ריכוזי האמוניה יחד עם זמני החשיפה על יעילות ההדברה של כל פטרייה. מאיור 12 ניתן להתרשם כי: א. יעילות ההדברה תלויה במכפלת ריכוז האמוניה בזמן החשיפה, כל פחיתה בגורם אחד מחייבת הגברה של הגורם השני לדוגמא איור 12C, מציין שליעילות הדברה של 60% יש צורך בריכוז אמוניה 8 מ"ג/ליטר בשילוב עם זמן חשיפה של 30 דקות. במידה שעולים לריכוז אמוניה 12 מ"ג/ליטר ניתן לרדת לזמן חשיפה של 15 דקות. ב. חלק מהפטריות מסוגלות להתמודד עם ריכוזי אמוניה נמוכים בקרקע ולכן יש צורך לעלות מעל ריכוז אמוניה מסוים (רמת סף) על מנת לקבל עיכוב/הדברה של הפטרייה (ספציפי לכל פטרייה). ריכוז הסף הוא למעשה נקודת החיתוך עם ציר ה X (מסומן בחץ שחור). ג. דירוג רגישות תפטיר הפטריות מהפחות רגיש לרגיש הוא כדלקמן:.(C),F. o. f. sp. lycopersici.(a),r. solani.(b),v. dahliae (D)..S. rolfsii יש לציין שההבדלים בין 3 הפטריות הראשונות הם קטנים, ההבדל המשמעותי הוא ברגישות הגבוהה של.S. rolfsii 58

66 (%) (דקות) זמן יעילות הדברה (מ"ג ריכוז NH /ליטר 3 אוויר) איור 12: השפעת ריכוז אמוניה ומשך החשיפה על יעילות ההדברה של 4 פטריות:.Sclerotium rolfsii (D),Verticillium dahliae יעילות ההדברה נקבעה ע"י הדגרה של הפטריות שנחשפו לאמוניה במצע המתאים למשך (A) 7 ימים, (B) 3 ימים, (C) 10 ימים, (D) 4 ימים. כל טיפול נעשה ב 6 חזרות. המחשה חזותית של השפעת חשיפה לאמוניה של תפטיר פטרייה בוצעה בהתאם לסעיף שתי פטריות, Rhizoctonia solani ו - rolfsii,sclerotium נצבעו באמצעות brightener).(calcofluor White M2R fluorecent בתהליך צביעה זאת הצבע "מקובע" באזורי הצמיחה של התפטיר ובכך הוא מהווה סמן לצמיחה שלאחר הסימון. ההסתכלות במיקרוסקופ לאחר חשיפת הקורים לרמות שונות של אמוניה, נתנה אינדיקציה, האם מאותו קודקוד מסומן, הקור המשיך להתפתח כרגיל או שחל עיכוב או עצירה בהתפתחות קורי התפטיר. ניתן להתרשם באיורים 13 ו 14 שבעוד בטיפולי הביקורת הייתה התפתחות קורים רגילה, הרי 59

67 שהתפתחות הקורים נעצרה או עוכבה לאחר חשיפה לאמוניה של 2 הפטריות. קור שנפגע קודקוד הצמיחה שלו מפסיק לגדול ומת. A B C D 44 μm איור 13: גדילה והסתעפות של קורים בתפטיר של,Rhizoctonia solani לאחר חשיפה לאמוניה (10 מ "ג /ליטר, 20 דקות חשיפה). הצילום נעשה באמצעות מיקרוסקופ (A) (X2000).,ultraviolet light - ביקורת ללא אמוניה, תפטיר, (B) תפטיר לאחר חשיפה לאמוניה (C) - ביקורת ללא אמוניה, קורים בודדים, (D) - קורים לאחר חשיפה לאמוניה 60

68 A B C D 44 μm איור 14: גדילה והסתעפות של קורים בתפטיר של,Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לאמוניה (1.5 מ"ג /ליטר, 10 דקות חשיפה). הצילום נעשה באמצעות מיקרוסקופ (A) (X2000).,ultraviolet light - ביקורת ללא אמוניה, מס' קורים, (B) ביקורת ללא אמוניה, קור בודד, (C) - מס' קורים לאחר חשיפה לאמוניה, (D) - קור לאחר חשיפה לאמוניה השפעת ריכוז אמוניה וזמן חשיפה על הישרדות גופי קיימא של פטריות פתוגניות. לאחר בחינת השפעת ריכוזי האמוניה וזמן החשיפה על תפטיר הפטריות, התבצע תהליך דומה עם גופי הקיימא של 3 מהפטריות: Verticillium dahliae,sclerotium rolfsii ו - Fusarium oxysporum.f sp. lycopersici בהתאם למוזכר (סעיף 3.5.2). בהשוואה בין הריכוזים הדרושים להדברה מלאה של תפטיר (איור 12) לבין הריכוזים הדרושים להדברה מלאה של גופי הקיימא (טבלה 25), יש 2 פטריות שבהם הריכוזים הדרושים להדברה מלאה של התפטיר היו גבוהים או דומים לריכוזים הדרושים להדברה מלאה של גופי הקיימא:.V dahliae תפטיר וגופי קיימא, 16 ו 14.8 מ"ג אמוניה/ל' בהתאמה ב- 30 דקות חשיפה. sp..f.o.f - lycopersici תפטיר וגופי קיימא, 8 ו 6.9 מ"ג אמוניה/ל' בהתאמה ב- 30 דקות חשיפה. היוצא דופן היה.S rolfsii שבו נדרשו להדברה מלאה של התפטיר וגופי הקיימא, 1.4 ו

69 מ"ג אמוניה/ל' בהתאמה ב- 10 דקות חשיפה. עבור V. dahliae ו - lycopersici F. o. f. sp. נבדקה גם חיוניות גופי הקיימא לאחר חשיפה סוב-לאטלית לאמוניה באמצעות בדיקה של יכולת הנביטה המחודשת של גופי הקיימא לאחר הפסקות תקופתיות באספקת חומרי מזון לפטרייה (סעיף 3.5.2). לא נמצאה פגיעה ביכולת הנביטה המחודשת גם לאחר 3 מחזורי הזנה/אי הזנה. טבלה 25: ריכוזי אמוניה וזמני חשיפה הדרושים להדברה של 100% גופי קיימא: כלמידוספורות - Verticillium - מיקרוסקלרוציות,Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.sclerotium rolfsii - קשיוניות,dahaliae ריכוז אמוניה (מ"ג/ליטר אוויר ( זמן חשיפה (דקות) Sclerotium rolfsii Verticillium dahaliae F. o. f. sp. lycopersici הערכים מייצגים ממוצע של חזרות לכל טיפול. יעילות ההדברה (%) נקבעה לאחר 6 ימי הדגרה. השפעת אמוניה ותכונות הקרקע על שרידות התפטיר של Sclerotium.Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו rolfsii 4.4 השפעת ריכוזי אמוניה על שרידות תפטיר של.S rolfsii ו lycopersici.f.o.f sp. נבחנה בקרקעות שונות (טבלאות 26 ו 27). ניתן לראות, כי ככל שמרקם הקרקע היה כבד יותר כך היה צורך בריכוז אמוניה גבוה יותר באווירת הקרקע לשם הדברה מלאה. לדוגמא בעוד שבחול הריכוז הדרוש להדברה מלאה היה עד 4 מ"ג אמוניה/ל', בקרקע גולן הריכוז הנדרש היה מ"ג אמוניה/ליטר. טבלה 26: השפעת אמוניה גזית באווירת הקרקע על מס' הפרופגולים החיונים לג' קרקע (CFU),Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (חשיפה של 4 שעות). של גולן 4 (חרסית) נחל עוז (סיין חרסיתי חולי) ראשל"צ (חול) נתניה 8 (סיין חרסיתי חולי) ריכוז אמוניה (מ"ג NH 3 /ליטר אוויר) 3375± ± ±850 50± ±1155 0± ±0 0± ±1000 0±0-0±0 12 0± הערכים מייצגים ממוצע של 4 חזרות. - לא נבדק בריכוז זה. 62

70 טבלה 27: השפעת אמוניה גזית באווירת הקרקע על מס' הפרופגולים החיונים לג' קרקע (CFU) של,Sclerotium rolfsii (חשיפה של 4 שעות). גולן 4 (חרסית) נחל עוז (סיין חרסיתי חולי) ראשל"צ (חול) נתניה 8 (סיין חרסיתי חולי) ריכוז אמוניה (מ"ג NH 3 /ליטר אוויר) 3875± ± ± ± ± ± ±50 0±0 0±0 4-0±0-0± ± ± הערכים מייצגים ממוצע של 4 חזרות. - לא נבדק בריכוז זה. מנגנון הפעולה של אמוניה: השפעה על תפטיר של Sclerotium rolfsii ו - lycopersici Fusarium oxysporum f. sp. בתנאי מעבדה. 4.5 בשלב זה בדקנו את השפעת החשיפה של הפטריות לאמוניה על הפעילות המטבולית שלהן ברמת התא. הניסויים בוצעו in vitro במעבדה וכללו את המדדים הבאים: דליפה/הפרשה מתאי הפטרייה (גלוקוז, חנקן אורגני, אשלגן), פעילות ATPase בממברנות הפלסמה, פעילות האנזים גלוטמט דהידרוגנז (GDH) ורמת ה.ATP הבדיקות בוצעו עם תפטיר של 2 פטריות,.f.F.o.S. rolfsii ו,sp. lycopersici דליפה/הפרשה של אשלגן, חנקן אורגני וגלוקוז מתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו rolfsii Sclerotium לאחר חשיפה לאמוניה נבדקה ההשפעה של חשיפת תפטיר פטרייה לאמוניה, על תקינות ממבראנות התאים, (סעיף 3.7.1). איור 15 מציג נתוני דליפת/הפרשת גלוקוז (A), אשלגן (B) וחנקן אורגני (C) מתאי תפטיר של.S. rolfsii הדליפה/הפרשה הייתה בדגם של עקום אופטימום. דליפת/הפרשת גלוקוז מהתפטיר עלתה מרמת רקע של 10* (ללא אמוניה) ל- 10* מ"ג/מ"ג ח"י (פי 1.5) בריכוז אמוניה של 0.8 מ"ג/ליטר אוויר ובריכוז המירבי שנבדק (1.2 מ"ג/ליטר אוויר) היא פחתה ל- 10* מ"ג/מ"ג ח"י. באשלגן הייתה עליה בדליפה/הפרשה מרמת רקע של 10* ל- 10* מ"ג/מ"ג ח"י (פי 2.0) בריכוז אמוניה של 0.8 מ"ג/ליטר אוויר. בחנקן האורגני הייתה עליה בדליפה/הפרשה מרמת רקע של 10* ל *3.5 מ"ג/מ"ג ח"י (פי 1.6) בריכוז אמוניה של 0.8 מ"ג/ליטר אוויר. מעניין לציין, כי הדליפה/הפרשה המירבית של שלושת הגורמים שנבדקו הייתה בריכוז אמוניה של 0.8 מ"ג/ליטר אוויר. מעבר לריכוז זה הדליפה קטנה ב- 3 הגורמים שנבדקו. 63

71 5.0E E E E-05 ג לו קוז ) מ" ג/ מ" ג ח" י) E A 1.0E E E E-03 א שלגן ) מ" ג/ מ" ג ח" י) E B 0.0E ריכוז אמוניה (מ"ג NH /ליטר 3 אוויר) 0.0E ריכוז אמוניה (מ"ג NH /ליטר 3 אוויר) 4.0E-03 C 3.0E E E E+00 חנ קן אורגני ) מ" ג/ מ" ג ח" י) ריכוז אמוניה (מ"ג NH3 /ליטר אוויר) איור 15: דליפה/הפרשה של גלוקוז (A), אשלגן (B) וחנקן אורגני (C) מתפטיר של Sclerotium rolfsii כתוצאה מחשיפה לאמוניה, משך החשיפה בכל ריכוז היה 20 דקות. כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. דליפות/הפרשות גלוקוז, אשלגן וחנקן אורגני מתאי תפטיר של.F.o.f sp. lycopersici (איור 16) הושפעו מאמוניה רק בריכוזים גבוהים יותר בסדר גודל בהשוואה ל - rolfsii.s. גם דגם הדליפה/הפרשה היה שונה בהשוואה לנ"ל. דליפת/הפרשת גלוקוז (A) פחתה כתוצאה מחשיפה לריכוזי אמוניה עד 4-8 מ"ג/ל' אוויר, פחיתה מרמת רקע של 10* ל *4.0 מ"ג/מ"ג ח"י. בריכוזים גבוהים יותר דליפת/הפרשת הגלוקוז התגברה במידה ניכרת ל *4.7 מ "ג/מ"ג ח"י (פי 3.6) בריכוז אמוניה של 20 מ"ג/ל' אוויר. דליפת/הפרשת אשלגן (B) עלתה עם העליה בריכוזי האמוניה, אולם בצורה מתונה יותר, עליה מרמת רקע של 10* ל *9.6 מ "ג/מ"ג ח"י (פי 1.5) בריכוז אמוניה של 2 מ"ג/ל' אוויר. בחנקן האורגני (C) הייתה מגמת ירידה בדליפה/הפרשה מרמת רקע של 10* לרמה של 10* מ"ג/מ"ג ח"י (פי 1.5) בריכוז אמוניה של 16 מ"ג/ל' אוויר. 64

72 6.0E E E E E E E+00 גלו קוז ) מ" ג/ מ" ג ח" י) A ריכוז אמוניה (מ"ג NH /ליטר 3 אוויר) 1.6E E E E E+00 C ריכוז אמוניה (מ"ג NH /ליטר 3 אוויר) חנקן אורגני ) מ" ג/ מ" ג ח" י) איור 16: דליפה/הפרשה של גלוקוז (A), אשלגן (B) וחנקן אורגני (C) מתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici כתוצאה מחשיפה לאמוניה. משך החשיפה בכל ריכוז היה 20 דקות. כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. במקביל לבדיקות לעיל נבדקו ה ph והמוליכות החשמלית של תמיסת הדלף (איור 17). ב rolfsii, S. ה ph (A) היה 4.7 ללא אמוניה ו 5.6 בריכוז האמוניה המרבי שנבדק 1.2) מ"ג/ל' אוויר) ה. - מוליכות החשמלית (B) הייתה 0.19 ds/m ללא אמוניה ו ds/m 0.3 בריכוז אמוניה של 0.8 מ"ג/ל'. בריכוזי האמוניה הגבוהים יותר הייתה מגמה של ירידה במוליכות, אבל הערכים היו דומים לזה של 0.8 מ"ג אמוניה/ל' אוויר בתמיסות שדלפו בטיפולי האמוניה. ב-.F o. f. sp. lycopersici ה. ph (C) היה 6.9 ללא אמוניה ו 9.4 בריכוז אמוניה של 8-16 מ"ג/ל' ה. - מוליכות החשמלית (D) עלתה באופן ישר מ - ds/m 0.18 ללא אמוניה ל 0.46 ds/m בריכוז האמוניה המרבי שנבדק (16 מ"ג/ל' אוויר). 65

73 6 A 0.4 B ph EC (ds/m) ריכוז אמוניה (מ"ג NH /ליטר 3 אוויר) איור 17: המוליכות החשמלית (ds/m,ec) וה ph של תמיסות הדלף של Sclerotium rolfsii ושל Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici לאחר חשיפה לאמוניה במשך 20 דקות. (A) ו,(B) ph ו מוליכות חשמלית rolfsii).(sclerotium.(fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ) ו מוליכות חשמלית ph,(d) ו (C) טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. כל פעילות האנזים גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) בתפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו rolfsii Sclerotium לאחר חשיפה לאמוניה במשך 20 דקות בדקנו את האפשרות שחשיפה של תפטיר פטרייה לאמוניה תשפיע על פעילות האנזים גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) שהוא אנזים מרכזי במטבוליזם של החנקן, תיאור הבדיקה מופיע בסעיף הפעילות המחזרת של גלוטמאט דהידרוגנאז - פעילות ספציפית ב - protein) (Units NADPH /mg בתפטיר של,S. rolfsii עלתה מ- 3.53*10-2 בתפטיר הלא מטופל ל- 10* (פי 6.2) בחשיפה לאמוניה בריכוז של 1 מ"ג/ל' אוויר (איור 18A). בריכוזי אמוניה גבוהים יותר חלה ירידה בפעילות האנזים. 66

74 פעילות הגלוטמאט דהידרוגנאז בתפטיר של,F. o. f. sp. lycopersici עלתה מ *10 בתפטיר הלא מטופל ל *3.09 (פי 1.5), בחשיפה לריכוז אמוניה של 10 מ"ג/ל' אוויר (איור 18B). פעילות האנזים בתחום ריכוזי אמוניה של 5-15 מ"ג/ל' אוויר הייתה קבועה למדי. Specific activity Units NADPH/mg protein ריכוז אמוניה (מ"ג NH /ליטר 3 אוויר) איור 18: הפעילות הספציפית של גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) בתפטיר של (A) Sclerotium rolfsii ושל - lycopersici (B) Fusarium oxysporum f. sp. לאחר חשיפה לאמוניה במשך 20 דקות. כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. הפעילות המחמצנת של גלוטמאט דהידרוגנאז protein) (Units NADP /mg הושפעה גם כן ע"י החשיפה במשך 20 דקות לאמוניה (איור 19). בתפטיר של.S rolfsii (איור 19A) היא עלתה מ *1.18 בהיקש ללא אמוניה ל *5.28 (פי 4.5) לאחר חשיפה ל 1 מ "ג אמוניה /ליטר אוויר. בריכוזי אמוניה גבוהים יותר חלה ירידה בפעילות האנזים. פעילות האנזים בתפטיר של F. o. f. sp. lycopersici (איור,(19B הייתה, בהתאמה *10 3 בהיקש ללא אמוניה ו *8.46 לאחר חשיפה לריכוז אמוניה של 10 מ"ג/ל' אוויר (פי 2.3). פעילות האנזים בריכוזי אמוניה של 5 ו 7.5 מ"ג/ל' הייתה שלילית (חיזור) ורק בריכוז אמוניה של 10 מ"ג/ל' הפעילות חוזרת להיות ערך חיובי. 67

75 Specific activity Units NADP/mg protein ריכוז אמוניה (מ"ג NH /ליטר 3 אוויר) איור 19 ה: פעילות הספציפית של גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) בתפטיר של (A) Sclerotium rolfsii ושל (B) Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici לאחר חשיפה לאמוניה במשך 20 דקות. כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. השפעת חשיפה לאמוניה על התכולה של ATP בתפטיר של Fusarium.Sclerotium rolfsii ו oxysporum f. sp. lycopersici הערכנו כי חשיפה לאמוניה תגרום לשינוי במטבוליזם של התא וכי הדבר ישפיע על רמת ה ATP בתא. הניסוי בוצע בהתאם לסעיף חשיפה לריכוז אמוניה נמוך (0.4 מ"ג/ל' אוויר) הורידה את כמות ה ATP ב - rolfsii.s, ביחס להיקש לא מטופל ) 10-10*2.8 מול לעומת 10* מול בהתאמה). ריכוזים גבוהים יותר של אמוניה ) מ 0.8 מ"ג/ל' אוויר ומעלה) גרמו לעליה בכמות ה ATP לעומת ההיקש הלא מטופל ) 10-10*8.6 מול לעומת 10* מול בהתאמה) א, יור 20A. ב-.F.o.f sp. lycopersici הייתה ירידה מונוטונית בתגובה לחשיפה לריכוזים גבוהים יותר של אמוניה (בהיקש הלא מטופל 10* מול ATP לעומת 10* מול 20B. בחשיפה המירבית לאמוניה, 12 מ"ג/ל' אוויר) איור ATP 68

76 מ(. Mole ATP ריכוז אמוניה (מ"ג NH /ליטר 3 אוויר) איור :20 תכולת ATP (מול (ATP בתפטיר של (A) Sclerotium rolfsii ו - f. Fusarium oxysporum (B) sp. lycopersici לאחר חשיפה לאמוניה במשך 20 דקות. כל טיפול נבדק ב 4 חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. פעילות האנזים ATPase בממבראנות תאי התפטיר של Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים דליפת/הפרשת גלוקוז, אשלגן וחנקן אורגני שנגרמה כתוצאה מחשיפה לאמוניה, יכולה להצביע על שינוי בתפקוד ממבראנות התאים. על מנת לבדוק אפשרות זו, בודדנו את ממבראנות הפלסמה והמיטוכונדריה מתאי הפטרייה.S rolfsii לאחר חשיפה לריכוזי אמוניה שונים, ובדקנו בהן את פעילות ATPase (סעיף 3.7.4). Bowman (1986) Bowman and ציינו שעיכוב של פעילות H + -ATPase באמצעות וונדט (vanadate) הביא לדפולריזציה מהירה של פוטנציאל הממבראנה. טבלה 28 מציגה השוואה בין פעילות ATPase "ג חלבון nm/ A) 660 בפלסמלמה וממבראנות המיטוכונדריה, וכן את השפעת ריכוזי האמוניה על פעילות ATPase בכל אחת מהממבראנות. פעילות ATPase בפלסמלמה גבוהה ב 2 סדרי גודל בערך מהפעילות בממבראנות מיטוכונדריה. פעילות ATPase בפלסמלמה ובממבראנות המיטוכונדריה עלתה לאחר חשיפה 69

77 מ( מ( מ( ה ו לאמוניה בריכוז עד 1 מ"ג/ל' אוויר. העליה בפעילות הייתה בשיעור פי 1.6 בפלסמלמה ופי 3 בממבראנות המיטוכונדריה בהשוואה לפעילות ללא חשיפה לאמוניה. לאחר חשיפה לריכוז אמוניה של 1.25 מ"ג/ל' אוויר פעילות ה ATPase פחתה. טבלה 28: פעילות האנזים ATPase בפלסמלמה ובממבראנות פלסמה ומיטוכונדריה בתאי תפטיר של Sclerotium rolfsii לאחר חשיפה לאמוניה במשך 20 דקות. ריכוז אמוניה "ג NH )/ליטר 3 אוויר) לא נמדד פעילות ATPase ממבראנות פלסמה "ג חלבון / 3.18± ± ± ±0.16 (A 660 nm - פעילות ATPase ממבראנות מיטוכונדריה "ג חלבון / nm (A ± ± ± ± ±0.000 השפעת ph ומוליכות חשמלית במצע על התפתחות התפטיר של Fusarium.Sclerotium rolfsii ו oxysporum f. sp. lycopersici הזכרנו לעיל (סעיף 4.5.1) כי ה ph והמוליכות החשמלית של תמיסות הדלף הגיעו לערכים מרביים של 5.6 ו 9.4 ושל 0.3 ו 0.46,dS/m ב- S. rolfsii ו lycopersici F. o. f. sp. בהתאמה. בודדנו את השפעת ה ph והמוליכות החשמלית על תאי התפטיר של.S rolfsii ו.F.o.f sp. lycopersici ע"י גידולם במצעי מזון עם ערכי ph ו EC דומים לערכים המירביים שהיו בניסויי הדליפה. ערכים אלה הותאמו באמצעות KOH ו HCl לפי הצורך. בניסוי הדליפה ה - ph ו EC נשתנו בהתאם לתוספות האמוניה ולדליפות מהתאים. בדיקת שיעור הגדילה התבצעה בהתאם לסעיף איור 21A מציג את שיעור גדילת מושבה (סמ"ר/יום) של.S rolfsii בהשפעת ה - ph מוליכות חשמלית. ניתן להתרשם ששיעור הגדילה לא היה נחות במצעים עם ה ph והמוליכות החשמלית הגבוהים יותר בהשוואה למצע הרגיל. שיעורי הגדילה של.F.o.f sp. lycopersici בכל המצעים ששילבו ערכי ph ומוליכות חשמלית שונים מזה של מצע PDA רגיל היו גבוהים בשיעור גדילת המושבה וחלקם באופן מובהק (ציור 21B). 70

78 A שיעור הגדילה (סמ"ר/יום) B טיפול איור 21: שיעור גדילת מושבה (סמ"ר/יום) של (A) (3 Sclerotium rolfsii ימי הדגרה) (B) Fusarium ph וב (ds/m) ימי הדגרה) כתלות במוליכות החשמלית 5) oxysporum f. sp. lycopersici של מצע הגידול. כל טיפול נבדק ב חזרות, הקווים האנכיים מייצגים את סטית התקן. 71

79 5. דיון השפעת במ"ס וחנקן אמוניקאלי על הפתוגנים, והיבול. התפתחות המחלות 5.1 המסקנה מעבודה זו שהפחתת גורמי מחלה בקרקע באמצעות יישום במ"ס וחנקן אמוניקאלי היא תוצאה של רעילות אמוניה גזית. יישום הבמ"ס מספק אמוניום מהמינרליזציה של החנקן האורגני של הבוצה, והוא גם מעלה את ה- ph לערך מתאים ( ) בו רוב האמוניום בקרקע ככולו מצוי בצורה הגזית הפעילה (איור 22). איור 22: תהליך הייצור של בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) ותכונות עיקריות של הבמ"ס. בעבודה הנוכחית הוספת הבמ"ס לקרקע העלתה את ph מיצוי תמיסת הקרקע בכל הקרקעות שנבחנו בתנאי מעבדה ובתנאי שדה כתלות בתכונות הבמ"ס והקרקע ובעומס הבמ"ס בקרקע. העלאת ה ph הייתה הכרחית לשם קבלת ריכוז אמוניה ביוצידי עם הוספת החנקן האמוניקאלי לקרקע (איור 23). בניסוי הליזימטרים (טבלה 13) ובניסוי הציפורן ב 2000/2001 (טבלה 17) ph הבמ"ס המוסף לקרקע היה 12, כתוצאה מכך ph מיצוי תמיסת הקרקע, בטיפולים שקיבלו במ"ס, היה גבוה באופן מובהק לעומת הביקורת, לאורך כחודש ממועד יישום החומר. לעומת זאת בניסוי בהדברת דוררת בתפו"א בגילת, ph הבמ"ס המוסף לקרקע היה 10.5, ולאחר 21 יום (טבלה 18), ph תמיסת הקרקע חזר לרמתו הרגילה בכל הטיפולים. בניסויי המעבדה התיצבות ה ph סביב הערך ההתחלתי ארכה בין 4-16 יום כתלות בכמות הבמ"ס המוספת, ובסוג הקרקע (טבלה 8). al (2008) Zasada et מצאו שבקרקע קלה (משקל נפחי 1.42 ג'/סמ"ק) היה 72

80 צורך ב- 10 ימים על מנת שהקרקע תחזור מ ph של 11 ל 8.5 לאחר הוספת במ"ס (2 טון לדונם על בסיס חומר יבש). הגורם העיקרי לירידה ב- ph תמיסת הקרקע הוא הקרבונציה של ההידרוקסיל החופשי עם CO 2 הנוצר בדגרדציה של החומר האורגני של הבוצה ועם ה - 2 CO אטמוספרי. ניתן לפיכך להניח כי קצב הירידה ב- ph יגדל ככל ששיעור הבוצה בבמ"ס יהיה גבוה יותר והבוצה תהיה פחות מיוצבת. העלת ph תמיסת הקרקע כתוצאה מהוספת במ"ס בלבד יכולה להשפיע על חיוניות הפתוגנים בקרקע. הוספת במ"ס בשיעור של 10.4 טון/ד' בקרקע חול סייני גרמה להדברה של 20% בקישיונות של Sclerotium rolfsii ו 35% בפרופגולים של F. oxysporum f. sp. dianthi כנראה בגלל עליית ה ph של מיצוי תמיסת הקרקע ל 10.4 (טבלה 9). השפעה דומה דווחה במספר עבודות: al. (1999) Peng et מצאו שעלית ph תמיסת הקרקע ל 10 הפחיתה נביטת מיקרוסקלרוציות של (1997) Vincent et al.,.f. o. f. sp. cubense מצאו שעלית ph תמיסת הקרקע ל 9 הפחיתה את אוכלוסיית Ralstonia solanacearum בקרקע. שילוב של במ"ס ph) תמיסת הקרקע) ועומס מתאים של חנקן אמוניקאלי (54.6 ק"ג/דונם), הביא להדברה מוחלטת של גופי קיימא של Verticillium dahliae, Sclerotium rolfsii,sclerotinia sclerotiorum ופרופגולים של F.oxysporum f. sp. dianthi (טבלה.(9 (2002a) Tenuta and Lazarovits השתמשו בבוצה מיוצבת בגיר בשיעור הוספה של 1% (w/w) עם 2% של קמח עצמות,(MBM) וקיבלו הדברה מלאה של מיקרוסקלרוציות של V.dahliae בקרקע חמרה לעומת טיפול של 4% MBM שהיה בעל השפעה גבולית. איור 23: תהליך הייצור של אמוניה משילוב בוצה מיוצבת בסיד (במ"ס) ודשנים חנקניים אנאורגנים. כל גורם שישפיע על ריכוז האמוניה החופשית בקרקע, ישפיע גם על יעילות ההדברה באמצעות אמוניה ובמ"ס. השפעת מרקם הקרקע על יעילות ההדברה הודגמה בניסויי המעבדה. בחול דיונה ובקרקעות בעלות מרקם חול סייני וסיין חולי קיבלנו הדברה מלאה של sp..f oxysporum.f dianthi בשיעורי יישום של 5.2 ו 7.8 טון/דונם במ"ס בהתאמה, ובתוספת של 55 ק"ג חנקן אמוניקאלי לדונם. בקרקע חרסיתית, יעילות ההדברה הייתה חלקית בלבד (76% הפחתה) גם 73

81 א( ב( ביישום של 21 טון במ"ס ו- 55 ק"ג חנקן אמוניקאלי לדונם (טבלה 8). בדומה Tenuta and (2004) Lazarovits יישמו כמויות שוות של קמח עצמות (MBM) לשם קבלת ריכוזי אמוניה, בקרקע חולית ובקרקע סיין. בקרקע החולית הייתה הדברה מלאה של מיקרוסקלרוציות של Verticillium dahliae לעומת אי הדברה בקרקע חמרה. יעילות ההדברה בקרקע באמצעות אמוניה מושפעת מאפשרות התנועה של אמוניה בקרקע. כך, הדברה של F.oxysporum.f sp. dianthi בשכבת הקרקע 0-20 ס"מ, הושגה ביישום של 10.4 טון במ"ס /דונם ו 16.2 ק"ג חנקן אמוניקאלי לדונם. הדברה דומה בעומק של ס"מ הייתה בעומס חנקן אמוניקאלי של 65 ק"ג/ד' (טבלה 10). תופעה דומה התקבלה בניסוי הדברת.F oxysporum.f sp. dianthi בגידול ציפורן בחלקות קטנות. יישום של 7.5 טון/ד' במ"ס בתוספת חנקן אמוניקאלי בשיעורי יישום מ 18 עד 72 ק"ג/ד' הפחיתו בצורה מובהקת את מס' הפרופגולים של.F oxysporum.f sp. dianthi בעומק 0-20 ס"מ. בשיעור יישום של 7.5 טון/ד' במ"ס ו 72 ק"ג/ד' חנקן אמוניקאלי הייתה פחיתה מובהקת במס' הפרופגולים של הפתוגן גם בעומק ו ס"מ (איור 3). המעניין הוא שכנראה שאמוניה נעה לעומק הקרקע וגרמה שם להדברת פוזריום, אע"פ שלא הייתה התאמה של ה ph בשכבות קרקע אלו. מדד נוסף ליעילות השימוש בבמ"ס וממקורות אמוניה הוא משך ההשפעה של הטיפולים על רמת הפתוגנים בקרקע. מההפחתה במס' הפרופגולים של.F oxysporum.f sp. dianthi בעומק ס"מ (איור 3), ניתן לראות כי השפעת התוספים (במ"ס + חנקן אמוניקאלי) הייתה מובהקת עד לפחות 250 יום ויותר מהיישום. השפעה ארוכת טווח של תוספים אורגנים על רמת הפתוגן בקרקע ועוצמת מחלה מוזכרים בעבודות אחרות: (1999) Conn and Lazarovits מצאו שהוספת זבל עופות הקטינה נגיעות ב scab potato ובנמטודות למשך שנתיים לעומת ביקורת ללא תוספים. הסבר להשפעה ארוכת הטווח ניתן למצוא בעבודה של (1963) Sequeira שמצא דיכוי של Fusarium oxysporum.f sp. cubense כאשר הוסיפו אוריאה לקרקע. לטענתו הדיכוי בשלב הראשוני נגרם ע"י אמוניה ובהמשך ע"י ריכוזים גבוהים של ניטריט כתוצאה מפגיעה בתהליך הניטריפיקציה (החיידק שאחראי על המעבר מניטריט לניטרט בתהליך הניטריפיקציה הוא Nitrobacter והוא מעוכב ע"י ריכוזים גבוהים של ניטריט, ph גבוה וכן ע"י אמוניה). רעילות האמוניה שנוצרה כתוצאה מהוספת הבמ"ס והחנקן האמוניקאלי אינה ספציפית לפתוגן מסויים אלא היא בעלת טווח רחב של פגיעה בפטריות וחיידקי קרקע, כפי שזה בא לביטוי בפחיתה במס' הפרופגולים של Verticillium dahliae ו - Rhizoctonia solani בניסוי תפו"א, גילת (טבלה 19, ו 21), ובעבודות אחרות שבהן נמצאה הדברה של פתוגנים בקרקע באמצעות: ). אמוניה שהשתחררה לקרקע מתוספים אורגניים (קמח עצמות, זבל חזירים וזבל עופות) לגבי Conn and lazarovits, 1999; ) Streptomyces scabies - ו Verticillium dahliae ). דשנים אמוניקאלים המוספים לקרקע כמו אמוניה אל מימית.(lazarovits et al., 2000 שהפחיתה אוכלוסייה של,(Smiley,1970) Fusarium roseum f. sp. cerealis אוריאה 74

82 ג( שהפחיתה אוכלוסייה של,(Chang,1999) Phellinus noxius ואוכלוסייה של Pythium ). שילוב.(Chun,1985) ultimum, Thielaviopsis basicola, Macrophomina phaseolina של תוספים אורגנים (זבל עופות) ודשן חנקני מינרלי (אוריאה) ש, הפחית נביטה של מנבגים של.(Tsao, 1980) Phytophthora cinnamomi ו Peronospora parasitica כל תוספת של מרכיב אורגני ודשן חנקתי לקרקע מעלה את המוליכות החשמלית ואת ריכוזי -N NH 4 ו 3 N-NO בתמיסת הקרקע. ואכן בניסוי הליזימטרים ובניסוי גילת המוליכות החשמלית של טיפולי הבמ"ס בשילוב החנקן היו גבוהים באופן מובהק לעומת הביקורת (טבלה 13 ו - 18). המוליכות החשמלית נבעה ברובה מהבמ"ס ומה CKD שיושם, ובמידה פחותה מהחנקן האמוניקאלי. בניסוי גילת, רמת המוליכות הגבוהה בטיפולי הבמ"ס גרמה לעיכוב בהתפתחות הצמחים בתחילת הגידול ורק לאחר מס' השקיות גדושות, טיפולי הבמ"ס יצאו מהעיכוב. את ההסתכלות על ריכוזי החנקן המינראלי ניתן לחלק ל 2 קטגוריות: 1. השפעה ישירה על המוליכות החשמלית של תמיסת הקרקע (העלת ריכוז המלחים). 2. נידוף חנקן אמוניקאלי לאטמוספרה. בניסוי הליזימטרים ריכוזי החנקן המינרלי ל 2 צורותיו בטיפולי הבמ"ס + החנקן היו נמוכים לעומת הביקורת (טבלה 13), יתכן וזה נבע מנידוף מואץ של אמוניה לאוויר (שילוב של במ"ס עם ph גבוה וחנקן אמוניקאלי). לעומת זאת בניסוי ציפורן 2000/2001 לא היה הבדל מובהק בין טיפול הבוצה לטיפולי הבמ"ס והחנקן האמוניקאלי ב- 2 צורות החנקן במרבית תאריכי הדיגום (טבלה 17). תוצאה דומה התקבלה בניסוי גילת (טבלה 18). הפחתת נידוף החנקן לאטמוספרה יתכן ונבעה משימוש בבמ"ס עם ph מתון יחסית וכיסוי בפוליאתילן למשך זמן ארוך יותר. כללית, יישום של כל חומר אורגני לקרקע מחייב התייחסות למוליכות החשמלית של תמיסת הקרקע לפני זריעה/שתילה של הגידול בשטח. יש צורך בהתאמה כמה שיותר מדויקת של רמת יישום התוספים לסוג הקרקע על מנת להימנע מהשפעה שלילית אפשרית של יישום במ"ס ודשנים חנקניים על תכונות הקרקע,pH) ו - (EC מחד גיסא ולקבלת הדברה יעילה מאידך גיסא. היבט נוסף של השימוש בבמ"ס ובדשן חנקתי הוא ההשפעה על הגידול החקלאי. הוספת במ"ס ודשן חנקני יכולה להשפיע במס' מישורים על הגידול החקלאי: הפחתת פתוגנים בקרקע, השפעה על תכונות כימיות של הקרקע (מוליכות חשמלית,,pH ריכוזי חנקן לצורותיו), השפעה על תאחיזת המים בקרקע (לא נבדק), השפעה על זמינות זרחה ויסודות קורט (לא נבדק) והשפעה על אוכלוסיות מיקרואורגניזם בקרקע (לא נבדק). יש לציין שבעוד שלהפחתת רמת הפתוגנים בקרקע יש השפעה חיובית על הגידול, הרי שלהשפעה על התכונות הכימיות יכולה להיות השפעה שלילית (מליחות גבוהה, ph גבוה, עודפי חנקן) או חיובית (תוספת חנקן לגידול). 75

83 השפעת ריכוז האמוניה, תכונות הקרקע, תכולת הרטיבות בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ספיחת אמוניה לקרקע ועל קבלת אמוניה גזית זמינה להדברה. 5.2 בחלק הראשון של העבודה זיהינו הבדלים ביעילות ההדברה בקרקעות שונות לגבי אותו פתוגן ).F ph הדרוש (טבלה 8). בהנחה,(oxysporum.f sp. dianthi גם כאשר הצלחנו להגיע ל שלהדברה מקסימאלית יש צורך להגיע לריכוזים ביוצידים של אמוניה בקרקע, מכאן שכל גורם המפחית את ריכוז האמוניה באוויר או תמיסת הקרקע ישפיע על יעילות ההדברה, גורם משמעותי בקביעת ריכוז האמוניה הביוצידי בקרקע הוא כושר הספיחה של הקרקע לאמוניה גזית. הוצעו מס' מנגנונים להסביר את הספיחה של NH 3 ע"י הקרקע. (1982) Nommik and Vahtras חילקו את מנגנוני תאחיזת האמוניה בקרקע ל 3 קטגוריות: 1. ספיחה ע"י חומר אורגני וחרסיות, 2. ספיחה פיזיקאלית 3. ספיחה כימית.(chemisorption) קרקעות אורגניות וקרקעות מינראליות עשירות בחומר אורגני הן בעלות קיבול גבוה יחסית לספוח Mattson and Koulter-Anderson, 1942; Broadbent et al., 1960; Lindbeck and),nh 3.(Young, 1965 קרקעות מינראליות עם תכולת חומר אורגני נמוכה סופחים כמות קטנה של אמוניה ביחס לכמות החנקן שניתנה (1982 Vahtras,.(Nommik and ספיחה פיזיקאלית היא הפיכה והיא מתרחשת תוך זמן קצר לאחר יישום NH 3 לקרקע ) ;1966 Papendick, Parr and Vahtras, 1982.(Nommik and ספיחה כימית היא לרוב המנגנון הדומיננטי של תאחיזת ה - NH 3 ע"י הקרקע, התיאוריות מאחורי המנגנון קושרות את היוניזציה של מולקולות ה - 3 NH ל -.(Mortland et al., (1963 והספיחה העוקבת ע"י אתרי חילוף הקטיונים NH 4 + ספיחת האמוניה לקרקע יבשה (איור 4) הייתה קשורה ישירות למרקם הקרקע (טבלה 5). ככל שתכולת החרסית בקרקע עלתה, כך גדל כושר תאחיזת האמוניה ע"י הקרקע, קרקע גולן 4 עם 56.2% חרסית, ספחה כ 6000 מ"ג אמוניה לק"ג קרקע. בתחום הביניים ניתן להתייחס לקרקע בית דגן עם 11.8% חרסית שספחה כ 1200 מ"ג אמוניה לק"ג קרקע ולבסוף קרקע ראשל"צ עם 3.1% חרסית שספחה כ 200 מ"ג אמוניה לק"ג קרקע. נתוני הספיחה מתיחסים לריכוז האמוניה המקסימלי שהוזרק לכל קרקע (25 מ"ג/ל' בכל הקרקעות, חוץ מגולן 4 שריכוז האמוניה המוזרק היה 35 מ"ג/ל'). הקשר בין תכולת החרסית בקרקע ויכולת הספיחה של האמוניה מוזכרת בעבודה של (2005) Dontsova et al שבה צוין שחרסיות הקרקע יכולות לאחוז כמויות גדולות של אמוניום בעודף על הקק"ח, ומחוץ לתחרות עבור אתרי חילוף, גם אחרי הסרה של גז NH 3 מהסביבה. באמצעות משוואת Langmuir חישבנו את האפיניות של הקרקעות לאמוניה (K), ואת קיבול הספיחה המרבי לאמוניה ) 0 X). ככל ש K קטן יותר כך גדלה האפיניות של הקרקע לאמוניה, ובין 2 המדדים קיים יחס הפוך: ככל ש K קטן יותר כך X 0 יהיה גדול יותר (טבלה 22). קרקע גולן 4 הייתה בעלת האפיניות הגבוהה ביותר (0.0104=K) מבין 6 הקרקעות שנבדקו, והחול 76

84 א( ב( ג( מראשל"צ היה בעל האפיניות הנמוכה ביותר (0.187=K). גם קיבול הספיחה של קרקע גולן 4 לאמוניה היה גבוה פי 50 בערך מאשר של החול; 20,000 לעומת 385 מ"ג/ק"ג קרקע, בהתאמה. בספרות יש נתונים לגבי כושר ספיחה של אמוניה בקרקעות שונות: (1977) Khengre et al מצא כושר ספיחה של 1620 מ"ג/ק"ג קרקע עבור קרקע חרסיתית עם קק"ח של 53 מא"ק/ 100 ג' קרקע. (1969), Nyborg שבחן יכולת קרקעות שונות לקבע אמוניה, מצא שקרקעות מינראליות עם תכולת חומר אורגני שנעה בין 2-9% ותכולת חרסית שנעה 8-56%, ספיחת האמוניה היתה בתחום שבין מ"ג/ק"ג קרקע. העבודה הנוכחית כושר הספיחה לאמוניה היה גבוה יחסית למוזכר בספרות, וההבדל נובע כנראה בעיקר מהעובדה שההתיחסות בעבודות אלו הייתה לספיחה כימית של האמוניה גזית.(chemisorption) קרקעות אלו אווררו באופן יסודי על מנת למנוע את הספיחה הפיזיקאלית של הגז. שינויי האנרגיה ב chemisorption הוא די גבוה ומכיוון שגז NH 3 לא יכול להיות מוסר תחת תנאים רגילים, תופעה זו נחשבת כספיחה לא הפיכה (1964 Harward,.(James and בעבודה הנוכחית, מרכיב הספיחה כלל הן את הספיחה הכימית והן את הספיחה הפיזיקאלית, המתאפיינת בקשר מימני בין מולקולת NH 3 לשטח הפנים של החרסיות. בתהליך הספיחה הפיזיקאלית, השינוי האנרגטי הוא יחסית נמוך ולכן הראקציות נחשבות כהפיכות ) and Brown.(Bartholomew, 1962; Brown and Harward, 1963 גורם נוסף המשפיע על תאחיזת האמוניה בקרקע הוא תכולת המים בקרקע. בדקנו את השפעתו באמצעות מדידת ריכוז האמוניה באווירה של קרקעות לחות לאחר חשיפתן לריכוזי אמוניה שונים יור 6). במרבית הקרקעות שנבחנו, ככל שעלתה תכולת הרטיבות בקרקע (יובש תנור, 50% מים זמינים, קיבול שדה) גדלה ספיחת האמוניה לקרקע. ממצא זה מתאים למה שמוזכר בספרות.,(1956) Jackson and Chang,(1947) Stanley and Smith ו - and McDowell (1958), Smith ציינו שאיבוד NH 3 N- (נידוף מהקרקע) היה מכסימלי לאחר יישום אמוניה אל מימית בקרקע שעברה ייבוש אוויר. הם גם מצאו שהפסדי N-NH 3 קטנו ככל שתכולת המים בקרקע התקרבה לקיבול שדה. השפעת המים נובעת מהגדלת יעילות הלכידה של האמוניה. אמוניה מתמוססת בפילם המים העוטף את חלקיקי הקרקע. היא עוברת ספיחה פיסיקלית, + ובהתאם ל- ph היא גם מגיבה עם מים ליצירת.NH 4 יון האמוניום יכול להספח לקומפלקס הסופח של הקרקע. הקרקע גולן 4 (חרסית) התנהגה בצורה שונה מהקרקעות האחרות: ספיחת אמוניה בקרקע היבשה הייתה גבוהה במידה ניכרת לעומת הקרקע הלחה. יתכן שהקשירה של האמוניה בקרקע היבשה נבעה (א). תגובה בין,NH 3 קבוצות הידרוקסיל ) - (OH ומולקולות מים הקשורות באופן מהודק אל מינראלי חרסית (1966 (Mortland, ). תגובות עם חומר אורגני. ). ספיחה ע"י מינראלי חרסית ומרכיבים אורגניים באמצעות קשרי מימן bonding) -H), קשירה פיזיקאלית. (1962) Brown and Bartholomew מצאו שחרסיות bentonite) ו (halloysite יבשות ספחו יותר אמוניה מחרסיות בתכולת רטיבות של 2.5% (משקלי) וב NH3 P של עד.Hg mm 60 הם 77

85 סברו, כי בקרקע המורטבת, אמוניה אחוזה בקשרי מימן מוחלפת בקלות ע"י מולקולות מים. הסיבה לכך שלמים יש 2 זוגות של אלקטרונים לא מזווגים לעומת NH 3 שיש לו רק זוג אחד. (1962 Bartholomew,,(Brown and והמשיכה של יונים טעונים חזק חיובית לאלקטרונים לא מזווגים אלה מספקת את המנגנון ליצירת הקשר. לכן, תחת תנאי הקרקע, תאחיזת NH 3 ע"י מנגנון זה יהיה בעל אופי חולף, ויהיה בעל חשיבות רק באזורים של ריכוזים גבוהים של NH 3 ובהעדר של מים (1966.(Mortland, שיווי המשקל בין ריכוזי האמוניה והאמוניום בתמיסת הקרקע נקבע ע"י ph תמיסת הקרקע לפי + o.(24 ריכוז האמוניה משוואת הנדרסון- הסלבלך: ph C) Log {[NH 3(g) ]/[NH 4 (aq) ]} = בתמיסת הקרקע נמצא בשיווי משקל עם ריכוז האמוניה באווירת הקרקע ולכן שינוי ה - ph של תמיסת הקרקע אמור להשפיע על ריכוז האמוניה באווירת הקרקע. כאשר העלנו את ph תמיסת הקרקע מ 7 ל הייתה ירידה בספיחה ב 3 הקרקעות בעלות המרקם בינוני-כבד (נתניה, נחל עוז, גולן). לעומת זאת, בחול (ראשל"צ) ההבדלים בספיחת האמוניה ברטיבויות השונות היו זניחים כנראה בגלל קיבול הספיחה הנמוך של החול (פחות מ- 1 מא"ק/ 100 ג'). כאשר מדרגים את ריכוז האמוניה שנמצא באוויר הקרקע לאחר הזרקת כמות נתונה של אמוניה (16.2 מ"ג/ל') ביחס לקק"ח הקרקע, ניתן לקבוע שריכוז האמוניה באווירת הקרקע הולך ויורד ככל שקק"ח הקרקע עולה. בקרקע חולית (ראשל"צ) עם קק"ח של 0.97 מא"ק/ 100 ג' היה ריכוז האמוניה באוויר הקרקע כ -93% מהכמות שהוזרקה לעומת 3% בקרקע גולן 4 עם קק"ח של 72.1 מא"ק/ 100 ג'. גם al. (1966) Parr et ו al. (1981) Ryan et מצאו מתאם שלילי בין קק"ח לנידוף NH 3 מקרקעות. מינימום של 25 מא"ק/ 100 ג' היה דרוש על מנת להפחית את נידוף NH 3 במידה משמעותית 1966) al., (1954) Blue and Eno.(Parr et מצאו שיעור גבוה של איבודי אמוניה ביישום של אמוניה אל-מימית בקרקעות חוליות. Tenuta and Lazarovits (2002, 2004) ו- Bremner (1989) Martens and ציינו כי נידוף אמוניה נמצא בקורלציה שלילית עם קק"ח, תכולת הסילט ותכולת החרסית, תכולת פחמן אורגני, ובקורלציה חיובית עם תכולת החול. סיכום סכמאטי של השפעת תכונות הקרקע על זמינות אמוניה לפעולת ההדברה ניתן לראות באיור

86 א( איור 24: השפעת תכונות הקרקע על פוטנציאל ההדברה של האמוניה. השפעת ריכוזי האמוניה וזמני החשיפה על הישרדות הפתוגנים ) in.(vitro 5.3 לאחר שכימתנו את השפעת הקרקע, תכולת המים בקרקע ו ph תמיסת הקרקע על ריכוז אמוניה גזית באווירת הקרקע, בדקנו מהו ריכוז האמוניה הדרוש להדברת תפטיר של מס' פטריות קרקע. מרבית הפטריות יכולות לנצל אמוניה כמקור חנקן יחיד. זה אופייני למגוון פטריות: Alternaria sp., Aspergillus sp., Botrytis sp., Cladosporium sp., Coprinus sp., Diplodia sp., Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium sp., Ustilago sp. (Morgan and 1970a. (MacMillan, 1954: Pateman et al., 1967: Lewis and Fincham, ואכן, ריכוזי אמוניה נמוכים וזמני חשיפה קצרים לאמוניה, מאפשרים גדילה נורמלית של שטח המושבה (יחסית לביקורת), כפי שהדבר בא לביטוי לגבי.R solani.v, dahliae ו - rolfsii.s יור 10). בדומה, (1980) Setua and Samaddar הראו, כי ריכוזי אמוניה נמוכים המריצו נביטת פרופגולים של Curvularia lunata, Penicillium chrysogenum ו oryzae.sclerotium יעילות ההדברה הייתה תלויה במכפלת ריכוז האמוניה בזמן החשיפה (חשיפה לאמוניה ללא תיווך של קרקע). כל פחיתה בגורם אחד מחייבת הגברה של הגורם השני (איור 12). עם זאת, בעבודה של al. (1999), Eshel et שבדקו הדברה של קישיונות של קישיון רולפסי כפונקציה של ריכוז מתיל ברומיד (C) וזמן יישום (T), מצאו שריכוז גבוה של מתיל ברומיד בפרק זמן קצר היה יעיל יותר מריכוז נמוך של מתיל ברומיד ופרק זמן ארוך (כאשר היה מדובר במכפלת C*T קבועה). כלומר יש לעבור רמת סף מסוימת על מנת לקבל אפקט של הדברה. זמן חשיפה וריכוז אמוניה מתאימים גרמו לעיכוב של התפתחות שטח המושבה וגדילת התפטיר (איור 11). האפקט מתגבר ככל שעולים בזמן החשיפה לאמוניה. ראינו, כי יש קשר לפגיעה בקודקוד הגדילה של הקורים (איור 13 ו - 14). 79

87 היה הבדל ברגישות לאמוניה בין הפטריות שנבדקו:.V dahliae ו - solani.r היו פחות רגישות מ - lycopersici F.o..f sp. והרגישה מכולן (בסדר גודל) הייתה.S. rolfsii תופעה דומה דווחה ע"י (1997) Candole and Rothrock שציינו שתפטיר של Thielaviopsis basicola היה רגיש יותר לאמוניה מתפטיר של Rhizoctonia solani או של.Pythium ultimum גם Setua (1980) and Samaddar ציינו שתפטיר של Helminthosporium oryzae היה פחות רגיש לאמוניה לעומת תפטיר של,Aspergillus oryzae ולטענתם, ההבדל ברגישות נבע מתכולה גבוהה יחסית של גלוקוז בתפטיר של.H. oryzae בדקנו את הרגישות לאמוניה גם של כלמידוספורות, מקרו/מיקרוקונידיות של sp..f.o.f,lycopersici מיקרוסקלרוציות של.V dahliae ושל קישיוניות של.S. rolfsii הריכוזים ומשכי החשיפה שהיו דרושים למניעה מלאה של הנביטה של גופי הקיימא היו דומים למדי לריכוזים שהיו דרושים להדברת התפטיר לגבי ) F.o. f. sp. lycopersici ו 8-10 מ"ג אמוניה/ליטר אוויר עבור גופי הקיימא והתפטיר, בהתאמה), ו - dahliae (14.8.V ו מ"ג אמוניה/ליטר אוויר עבור גופי קיימא ותפטיר, בהתאמה). לעומתם, הריכוז שנדרש להדברת הקשיונות.S rolfsii היה גדול פי 2-4 (בהתאם למשך החשיפה) לעומת הריכוז שנדרש להדברת התפטיר ( ו מ"ג אמוניה/ליטר אוויר עבור גופי קיימא ותפטיר, בהתאמה). נציין, כי חשיפה לריכוזים תת-לטאליים של אמוניה לא השפיעה כלל על יכולת הנביטה של גופי קיימא של.V. dahliae - ו.F. o. f. sp lycopersici השפעת ריכוז האמוניה הגזית באוויר ותכונות הקרקע על שרידות תפטיר של Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ו Sclerotium rolfsii בקרקע. 5.4 עד כה, ראינו כי כדי לקבל הדברה מוצלחת של הפטריות בקרקע, ריכוז האמוניה הגזית צריך להיות מספיק גבוה, מעל ערך סף מסויים. שילוב סוגי קרקע שונים עם ריכוזי אמוניה שונים והשפעתם על הדברת.F. o. f. sp lycopersici ו - rolfsii S. (טבלה 26 ו (27 אימתו את התצפית שככל שהקרקע כבדה יותר, יש צורך בריכוזי אמוניה גבוהים יותר לקבלת הדברה מלאה. לא היה הבדל ברגישות של שתי הפטריות לאמוניה, משך חשיפה ארוך דיו בריכוזי אמוניה דומים פגעו במידה שווה ב 2 הפטריות. ריכוזי האמוניה (מ"ג/ק"ג קרקע) שהיו דרושים להדברה מלאה של.S rolfsii היו: בקרקע ראשל"צ (חול) ונתניה (חול סייני) - 400, נחל עוז (סיין חרסיתי חולי) 800, גולן 4 (חרסית) 2400 במשך חשיפה של 4 שעות. כאשר משווים זאת לנתונים מהספרות רואים שסדרי הגודל הם דומים. - Pythium ultimum 1900 מ"ג/ק"ג קרקע לאחר 4 ימי חשיפה. Macrophomina Chun) מ"ג/ק"ג קרקע לאחר 4 ימי חשיפה Thielaviopsis basicola,phaseolina Sequira, ) מ"ג/ק"ג קרקע F. oxysporum f. sp. cubense (and Lockwood,

88 ,(1963 noxius - Phellinus 1300 מ"ג/ק"ג קרקע 1999) Chang,.(Chang and השוואה בין ריכוז החנקן האמוניקאלי בניסוי הדברת F.oxysporum.f sp. dianthi בגידול ציפורן בקרקע בית דגן (טבלה 17) לבין הריכוז שהיה דרוש להדברה בקרקע נתניה (סיין חרסיתי חולי) (טבלה 26) נתנה את התוצאות הבאות: בקרקע בית דגן ריכוז החנקן האמוניקאלי האנאורגני המקסימאלי שניתן היה 72 ק"ג/ד' (שווה ערך ל 280 מ"ג חנקן בצורה של אמוניה לק"ג קרקע ב ph = 12), ובהנחה שהייתה תוספת קטנה של חנקן אמוניקאלי מהבמ"ס (טבלה 17), הערך המקסימלי שיתקבל היה 300 מ"ג אמוניה/ק"ג קרקע. בקרקע נתניה (סיין חרסיתי חולי) ריכוז החנקן האמוניקאלי היה זה היו קרובות לתוצאה שהושגה בניסוי השדה. 400 מ"ג אמוניה/ק"ג קרקע ומטה, כך שתוצאות הניסוי במעבדה במקרה Fusarium מנגנון הפעולה של אמוניה על Sclerotium rolfsii ו.oxysporum f. sp. lycopersici 5.5 אמוניה גרמה לעיכוב ו/או קטילה מלאה של מיגוון פטריות קרקע שנבדקו, והיו הבדלים ברגישות של הפטריות לאמוניה. על מנת לנסות ולהבין את השפעת האמוניה על הפטריות השונות, בחנו מס' גורמים ותהליכים הקשורים למטבוליזם של הפטריות אשר צויינו בעבר ככאלה היכולים להיות מושפעים מאמוניה. ph השפעת ריכוזי האמוניה על ה - חשיפה של התפטיר של.S rolfsii לריכוז האמוניה המקסימאלי (1.2 מ"ג/ליטר אוויר) העלתה את ה ph על שטח הפנים החיצוני של הפטרייה. ה ph עלה מ 4.7 ל 5.7 (איור 17A). תחום ph אופטימלי לצמיחה של תפטיר ולנביטה של קישיוניות הוא ולא נמצאה גדילה מעל ל ph של 1982) 8 Grogan,,1967) Henis and Chet.(Punja and (1968 ציינו שאובדן כושר נביטה של קשיוניות של.S rolfsii התקבל ב - ph קרוב ל 10. and Setua (1980) Samaddar מצאו שלא היה עיכוב בנביטת פרופגולים של.S rolfsii בתחום ph של 7.2 עד 8.5. מכאן, הפגיעה בפטרייה הייתה בגלל נוכחות האמוניה והיא לא נגרמה כתוצאה מעליית ה.pH.F. o. f. sp lycopersici נחשפה לריכוזי אמוניה גבוהים יותר (איור.(17C ה ph בשטח הפנים החיצוני של התפטיר עלה מ ללא אמוניה ל- 9.5 בריכוז האמוניה המקסימאלי (16 מ"ג/ל'). בעבודת המוסמך של ליאת רודד (2005) נמצא ששיעור הפחיתה באינוקולום של F. o. f. sp lycopersici היה 11% ב ph (1990) Depasquale and Montville.10.3 הראו שקורים של Penicillium griseofulvum ו graminearum Fusarium היו בעלי ph פנימי של 8 כאשר ה ph בסביבה החיצונית הגיע ל 9.5, וחיוניות הקורים לא נפגעה בצורה משמעותית. מכאן שגם במקרה זה עליית ה- ph כשלעצמה לא היתה ככל הנראה הגורם המרכזי בפגיעה בתפקוד הפטרייה. 81

89 5.5.2 יציבות ממברנת הציטופלזמה המדד ליציבות ממברנת הפלסמלמה לחשיפה לאמוניה ב 2 הפטריות היה מידת הדליפה/הפרשה מתאי התפטיר של גלוקוז, אשלגן וחנקן אורגני (איור 15 ו 16). דליפת/הפרשת אשלגן הוזכרה בעבודות נוספות כמדד טוב למדידת שינויים בחדירות הפלסמלמה בעקבות פגיעה בממבראנה כתוצאה מחשיפה לחומרים הפועלים על שטח הפנים של הממבראנה.(Lambert and Hammond, 1973: Rodriguez-Navarro, 2000) ב-.S rolfsii תחום הריכוזים שנבדק היה מ"ג/ל'. בתחום עד 0.8 מ"ג/ל' הייתה עלייה בדליפה/הפרשה של כל המרכיבים. שיא הדליפה/הפרשה היה בריכוז אמוניה של 0.8 מ"ג/ל' (גלוקוז פי 1.5, אשלגן פי 2 וחנקן אורגני פי 1.6 בהשוואה לביקורת), וב 1.2 מ"ג/ל' הייתה פחיתה בדליפה/הפרשה בכל המרכיבים לעיל. (2006) Singh et al מצא שחשיפה של תפטיר של Ophiostoma floccosum ל MBT (methylene bisthiocyanate) גרם לעליה בדליפת האשלגן מקורי הפטריה ככל שעלה ריכוז ה,MBT אבל בריכוז המקסימאלי mm) 100) דליפת האשלגן פחתה יחסית לדליפה בחשיפה ל - mm 10. ההסבר לכך היה שהייתה חסימה של הנקבובים בממברנה הפגועה כתוצאה משקיעה של MBT בריכוז הגבוה לאורך הפלסמלמה.(Lambert and Smith, 1976) ב - lycopersici.f,.o.f sp ההתנהגות הייתה שונה. דליפת/הפרשת הגלוקוז בריכוזי אמוניה נמוכים השתוותה ) 2 מ "ג/ל') או פחתה בצורה מובהקת ) 4 מ "ג/ל') לעומת הביקורת. בריכוזי אמוניה גבוהים מ 8 מ "ג/ל' ואילך החלה דליפה/הפרשה ניכרת של גלוקוז יחסית לביקורת (בריכוז אמוניה של 16 מ"ג/ל', דליפת/הפרשת הגלוקוז הייתה פי 3.6 לעומת הביקורת). יתכן שהפחיתה בדליפת/הפרשת הגלוקוז בריכוז אמוניה של 4 מ"ג/ל' הייתה עקב עליה בצריכת הגלוקוז כתוצאה מהחשיפה לאמוניה כחלק ממנגנון ניטרול עודפי האמוניה. יתכן שמנגנון זה קיים גם ב - rolfsii.s בריכוזי אמוניה הנמוכים מריכוז האמוניה המינימאלי שניבדק (0.4 מ"ג/ל'). תופעה דומה צויינה ע"י (1984) Chun et al שעבדו עם קורי הפטרייה,Cochliobolus sativus ומצאו שחשיפה לריכוזי אמוניה עולים עד מ"ג/ל', גרמה לפחיתת הפרשה של פחמן מסומן ככל שריכוזי האמוניה עלו. ורק בחשיפה לריכוז אמוניה מעל 100 מ"ג/ל', הפרשת הפחמן הלכה ועלתה ככל שריכוז האמוניה עלה. העליה בהפרשת הפחמן הייתה במקביל לירידת בחיוניות הפרופגולים של הפטרייה. al. (2006) Singh et מצאו גם שחשיפה של תפטיר של Ophiostoma floccosum ל ריכוזים הנמוכים של,MBT גרמה לצריכה של גלוקוז. לעומת זאת, בריכוזים הגבוהים לא הייתה צריכה של גלוקוז. al. (1995) Schure et מצא שהזנה של Saccharomyces cerevisiae בריכוזי אמוניה וגלוקוז הולכים וגדלים הקטינה את ריכוז האמוניה השאריתי והגדילה את ריכוז הגלוקוז השאריתי בתמיסת ההזנה. יתכן והסבר לתופעה זו היה בדיכוי הנשימה כתוצאה מחשיפה לאמוניה al.,1984).(chun et 82

90 דליפת/הפרשת האשלגן החלה מריכוזי האמוניה הנמוכים ולא השתנתה באופן מובהק ככל שעלינו בריכוזי האמוניה (פי 1.5 לעומת הביקורת). לעומת זאת, לא נמצאה עליה בדליפה/הפרשה של חנקן אורגני כתוצאה מעלייה בריכוזי האמוניה, אלה התקבלה מגמה הפוכה לא מובהקת של ירידה בדליפה/הפרשה ככל שעלינו בריכוזי האמוניה. דליפה של betacyanin ומומסים נוספים מתוך ממבראנות תאי השורש של סלק כתוצאה מחשיפה למלח של (NH 4 ) 2 SO 4 נמצאה בעבודתם של (1976). Poovaiah and Leopold לטענתם אמוניום בניגוד לסידן גורם לחוסר ייצוב של הממבראנה וע"י כך מגביר את חדירותה. דליפה של אלקטרוליטים בפטרייה Rush and כתוצאה מחשיפה לאמוניה נמצאה בעבודה של Phymatotrichum omnivotum Enriquez- הדליפה שוייכה להפרעה בפעילות התקינה של ממבראנות התאים. (1982), Lyda al. (1999) Freire et מצאו שתאי שמרים מפרישים יוני אשלגן בנוכחות של גלוקוז, וע"י כך נשמר ריכוז תוך-תאי קבוע של אשלגן. מצד שני, כאשר יש מחסור במקורות פחמן כמו גלוקוז, לא נמצאה יציאה אקטיבית של יוני אשלגן (ריכוז האשלגן התוך תאי הרצוי לא נשמר). בניסוי אחר נמצאה דליפה מוגברת של יוני אשלגן מתאי שמר כתוצאה מחשיפה ל Nonyl.(Fujita and Kubo, (2002 gallate הפגיעה בשלמות הממבראנות הביאה לתמותת התאים. חשיפה של תאי שמר לשמן עץ התה הגדילה את חדירות ונזילות הממברנה ע"י הכנסה של טרפנים בין שרשרות fatty acyl שמרכיבות את הליפידים בממברנה הדו-שכבתית, וע"י כך מפריעים לארגון של הממבראנה וגורמים לשינויים בתכונותיה ובתפקודה ) et Hammer.(al.,2004 כאשר חשפו תאי שמר לאתנול, נמצא שאשלגן ציטוזולי השתחרר במהירות למדיום החיצוני כתגובה לעליה בחדירות הממבראנה שיכולה לגרום לדהפולריזציה של הממבראנה (כניסה של מטענים חיובים לציטופלזמה) ללא ריכוז של אשלגן חיצוני מספק ) and Mizoguchi.(Hara,1998 עבודות שנעשו עם + Rb או + Rb ו + K אשרו את קיומו של שטף אשלגן חיצוני מהתא והראו שהוא אינו תלוי ב ph החיצוני, אבל הוא מעוכב ע"י ירידה ב ph הפנימי של התא Saccharomyces cerevisiae כאשר תאי תפטיר של.(Rodriguez-Navarro, (2000 מטופלים עם מפירי צימוד או תרופות החוסמות את מטבוליזם האנרגיה מקבלים שטף חיצוני של אשלגן שהוא גבוה יותר מהאשלגן שנקלט ע"י התאים al.,1990) Begona et al..(ramos et (2002) מצאו שבקבוצות שונות של פטריות כמו: שמרים, המיאסקומיצטים ו - Neurospora יש משאבות אשלגן ATPase) K) + -efflux שמתווכות בתהליך הפרשת אשלגן מתוך התא כאשר ה ph החיצוני גבוה. הפרשה של חומצות אמינו (אלאנין, ולין, פרולין, גלוטמאט, גלוטאמין) נמצאה בפטרייה Saccharomyces cerevisiae כתגובה לריכוזי אמוניום עולים, וההנחה הייתה שמדובר במנגנון לניטרול עודפי האמוניום 2006) al., (1984) Punja et al..(hess et מצאו דליפה של חומצות אמינו ופחמימות מקשיונות מיובשים של.S rolfsii כתוצאה מחשיפה לחציר אספסת. יש לציין 83

91 שבעבודה הנוכחית לא נמצא שחשיפה של קשיונות של.S rolfsii לריכוזי אמוניה עולים השפיעה על דליפה של אשלגן, חנקן אורגני או גלוקוז מהקשיונות (מידע שלא פורסם) פעילות האנזים גלוטמאט דהידרוגנאז (GDH) האנזים גלוטמט דהידרוגנז (GDH) מזרז ראקציה הפיכה המסנתזת גלוטמט בכיוון האחד (אמינציה), או עושה דאמינציה של גלוטמט כשהכיוון הפוך. לפיכך, GDH יופיע ברוב הפטריות, ב 2 צורות: אחת הדורשת NADPH והאחרת הדורשת.Marzluf, (1981) NADP 2-Oxoglutarate + NH NAD(P)H Glutamate+H 2 O +NAD(P) + ב - crassa Neurospora ובמס' שמרים וחיידקים, GDH נחשב כאנזים החשוב ביותר בהטמעה + של NH 4 כאשר ריכוזי האמוניום החיצונים גבוהים 1980) al.,.(brown et al., 1974; Mora et NH 4 + המסלול GS/GOGAT (גלוטמין סינתטז וגלוטמט סינתז) נחשב כחשוב יותר בהטמעה של + בצמחים כאשר ריכוזי NH 4 החיצונים נמוכים 1980) al.,.(miflin et גם בעבודה הנוכחית ראינו שפעילות גלוטמט דהידרוגנז protein) (Units NADPH /mg עולה בתגובה לאמוניה, אלא שדפוס התגובה היה שונה בין 2 הפטריות. בתפטיר של S. rolfsii (איור 18a), הפעילות עלתה עד פי 6 עם עליה בריכוז האמוניה עד ריכוז 1 מ"ג/ל', והיא ירדה בריכוז גבוה יותר. לעומת זאת, בתפטיר של.F.o.f sp. lycopersici (איור 18b), פעילות הגלוטמאט דהידרוגנאז עלתה מערך של 10* בטיפול ללא אמוניה לפעילות מכסימלית של 10* בריכוז אמוניה של 10 מ"ג/ל' (פי 1.5). הפעילות הספציפית בתחום ריכוזי אמוניה של 5-15 מ"ג/ל' הייתה דומה למדי. ההבדל בין 2 הפטריות היה בריכוז האמוניה בשיא פעילות האנזים, שהיה פי 10 ב - lycopersici F. o. f. sp לעומת.S. rolfsii הגברת פעילות האנזים כתגובה לעליה בריכוזי האמוניה דווחה ע"י al. (1985). St. John et הם הראו כי עלייה בפעילות GDH התרחשה במקביל לעלייה בריכוז אמוניום חיצוני וב ph התוך תאי. גם al. (1995) Schure et מצאו עליה בפעילות GDH ו GS (גלוטמין סינטאז) בעקבות עליה בריכוז האמוניה בתמיסת ההזנה. העלייה בפעילות ה - NADP-GDH בפטרייה, בתגובה לחשיפה לריכוזי אמוניה עולים יכולה להיות מיוחסת: 1. עליה בסינתזת האנזים. 2. הפעלה של האנזים בנוכחות אמוניה. במקביל לראקציה המסנתזת גלוטמט, בדקנו את תהליך הדאמינציה של גלוטמט באמצעות גלוטמאט דהידרוגנאז protein).(units NADP /mg בתפטיר של.S rolfsii (איור 19a) פעילות האנזים עלתה מערך של 10* בטיפול ללא אמוניה לפעילות מכסימלית של 10* (פי 4.5) בריכוז אמוניה של 1 מ"ג/ל'. מעל ריכוז אמוניה של 1 מ"ג/ל' חלה ירידה בפעילות הספציפית של האנזים (אופיין של עקום אופטימום בדומה לתהליך האמינציה). בתפטיר של F. o. f. sp. lycopersici (איור 19b) הפעילות עלתה מערך של 10* בטיפול ללא אמוניה לפעילות מכסימלית של 10* בריכוז אמוניה של 10 מ"ג/ל' (פי 2.3). הפעילות הספציפית של האנזים בריכוזי אמוניה של 5 ו 7.5 מ"ג/ל' הראתה ערכים שלילים. יתכן שפעילות האמינציה הייתה 84

92 גדולה יותר בהשוואה לפעילות הדאמינציה של הגלוטמאט דהידרוגנאז עקב אפיניות גדולה יותר. רק בריכוז אמוניה של 10 מ"ג/ל' הפעילות חזרה להיות ערך חיובי. בהשוואה בין 2 צורות האנזים, ניתן להבחין שפעילות ה - NADPH-GDA גדולה בסדר גודל מפעילות ה - NADH-GDH ב - rolfsii.s, ממצא זה נמצא במס' עבודות נוספות: St. John et al. (1985) טענו שפעילות ביוסינתטית (NADPH-GDA) תורמת עד 85% מסה"כ פעילות ה + GDH תחת תנאי זמינות גבוהה של.NH 4 כשאמוניום מנוצל, הפעילות הביוסינתטית יורדת, לעומת זאת הפעילות הקטבולית של (NADH-GDH) GDH נשארת יחסית קבועה בתחום רחב + של ריכוז.NH 4 הירידה בפעילות GDH מתרחשת במקביל עם הירידה בריכוז החיצוני של האמוניום וב ph הפנימי. (2005) Noor & Punekar מצאו ב - niger Aspergillus שיש העדפה של האנזים (ערכי K) m לכיוון יצירת,glutamate והעדר עיכוב של תגובה זו ע"י ריכוזי glutamate mm) (1992) Brun et al..(>100 מצאו שב- ph האופטימאלי לקיום הראקציה, שיעור האמינציה היה פי 10 גבוה יותר מזה של ראקציית דאמינציה. הירידה בפעילות האנזים NADPH-GDA ב - rolfsii.s החל מריכוז אמוניה של 1 מ"ג/ל' יכולה להיות מיוחסת למחסור בפחמן כפי שנמצא בעבודות שנעשו ע"י (1978) Hemmings לגבי Candida utilis ו - Leslie (1985) Kinzel and לגבי Gibberella zeae שדיווחו על ירידה מהירה בפעילות NADPH - GDH כתוצאה ממחסור בפחמן זמין. פעילות של NADP-GDH נמוכה בתאים כאשר גלוקוז נוכח. בתאים שעוברים הרעבת פחמן, או כאשר חומצות אמינו הם מקור הפחמן, יש עלייה פי 5 עד 8 בפעילות של NADP-GDH NADP- יתכן שממצא זה מסביר את פעילות האנזים.(Kinghorn and Pateman, (1974b GDH ב lycopersici.f.o.f sp. כאשר הייתה פחיתה בפעילות בריכוזי האמוניה הנמוכים (גלוקוז מספק), ועליה בפעילות האנזים בריכוזי אמוניה גבוהים (הרעבת פחמן). פעילות ATPase בפלסמלמה ובמיטוכונדריה של תאי התפטיר ותכולת ATP בתפטיר על מנת להבטיח פעילות אופטימאלית של המסלולים המטבוליים העיקריים, יש צורך בהרחקה קבועה של פרוטונים חופשיים מהציטופלזמה (1998.(Bracey, תהליך זה מתווך ע"י הפעילות של P-ATPase שנמצא בממברנת הפלסמה באמצעות הידרוליזה של.ATP ההעברה הפעילה של + H מהתא החוצה דרך ממברנת הפלסמה יוצרת מפלי ph ופוטנציאל חשמלי, המניעים את העברה של חומרים רבים אחרים באמצעות חלבוני העברה פעילה משנית שונים 1988) Serrano, ATPase.( Eddy, 1982; Serrano, 1984; שומר על הומוסטאזיס של ה ph התוך תאי, וחיוני לגדילה של הפטרייה (1986.(Serrano, בתפטיר של.S rolfsii שנחשף לריכוזי אמוניה עולים היתה עליה בפעילות P-ATPase עד לריכוז של 1 מ"ג/ל' אמוניה (טבלה 28). בריכוז של 1.25 מ"ג/ל' הייתה ירידה בפעילות האנזים. יתכן והעליה בפעילות האנזים נובעת מתהליך הבססה שמתרחש עם החשיפה לאמוניה בסביבה הקרובה לשטח הפנים 85

93 החיצוני של ממברנת הפלסמה. על מנת לשמור על המפל האלקטרוכימי שעל פני הממברנה יש הפרשה של פרוטונים החוצה תוך כדי הידרוליזה של.ATP כאשר מכמתים את רמת ה ATP בקורי הפטרייה ביחס לריכוז האמוניה (איור 20a) ניתן להבחין שבריכוז אמוניה של 0.4 מ"ג/ל' יש פחיתה ברמת ה ATP בתאי הפטרייה. פחיתה זו יתכן ומייצגת צריכה של ATP ע"י משאבת הפרוטונים. בריכוזים של 1 מ"ג/ל' אמוניה ומעלה מתחילה הצטברות של ATP בתאי הפטרייה שניתן ליחס אותה, לפחות בחלקה, לירידה בפעילות של (1991) Serrano.P-ATPase מצא שפעילות P-ATPase יכולה לצרוך עד 60% מסה"כ ה ATP שנמצא בתא. ה ATPase הנמצא בממבראנות הפנימיות של המיטוכונדריה מכונה,F-ATPase ותפקידו לסנתז ATP באמצעות האנרגיה החופשית האצורה במפל הפרוטונים האלקטרו כימי שעל פני הממבראנה. ה - F-ATPase יכול לפעול גם בכיוון ההפוך ולשמש משאבת פרוטונים ע"י ניצול אנרגיה מהידרוליזה של ATP להעברת + H דרך הממבראנה Bowman,1986).(Bowman and כאשר בדקנו את השפעת האמוניה על פעילות F-ATPase במיטוכונדריה, בדקנו למעשה את תיפקודו כמשאבת פרוטונים הצורכת.ATP פעילות האנזים עלתה פי 3 כאשר תאי הפטרייה נחשפו ל 1 מ "ג/ל' אמוניה בהשוואה לביקורת ללא אמוניה (טבלה 28), וירדה לאחר מכן לרמת הביקורת ברמת אמוניה של 1.25 מ"ג/ל'. הסבר לעליה ברמת ה ATP בריכוז אמוניה של 1 מ"ג/ל' ומעלה יתכן וניתן למצוא בעבודה של (1973) Matsumoto and Wakiuchi שציינו שעליה בריכוז ה ATP קשורה להאצה של מטבוליזם הנשימה, וכן דיכוי ביוסינטזה של מרכיבים בעלי משקל מולקולרי גבוה התלוייה ב ATP ה, מתרחשת במהלך הרעלת אמוניה. האצה של מטבוליזם הנשימה גורמת לעליה בכמות ה ATP הנוצרת, שיכולה לגרום ל ATPase במיטוכונדריה להפוך מ ATPase סינטאז ל ATPase שמבצע הידרוליזה (1986 Bowman,.(Bowmwn and מהלך זה מתקשר לעובדה שחשיפה לאמוניה משפיעה על ה ph התוך-תאי, דבר המוביל לעליה בחדירות הפרוטונים לתוך המטריקס של המיטוכונדריה (החדירות לפרוטונים ) 1- cm*s,p) בממבראנות ביולוגיות תלויה ב-,pH עם ערכים בין לבין ph קטנים עם ערכי P כאשר הערכים של,cm*s נמוכים, (1984)), Gutknecht ולכן יש צורך בהידרוליזה של ATP על מנת לשאוב את עודפי הפרוטונים מחוץ למטריקס של המיטוכונדריה. פעילות ATPase בתפטיר של.S rolfsii (טבלה ( 28 הייתה דומה לדפוס הפעילות של גלוטמט דהידרוגנז (איור 18a) בתגובה לריכוזי האמוניה. ב- Fusarium oxysporum.f sp. lycopersici יש מגמה של ירידה בתכולת ה ATP (איור 20b), שמהווה מדד לפעילות של GDH (איור 18b) ואולי משאבות פרוטונים גם בריכוזי אמוניה של 12 מ"ג/ל'. ניתן לנסות ולהבין את הרגישות הגבוהה יותר של.S rolfsii לאמוניה בהשוואה ל - Lycopersici Fusarium oxysporum f. sp. (איור (12 לפחות באופן חלקי, באמצעות השוואת המדדים השונים שנבדקו. שני הפרמטרים המרכזיים שיכולים להצביע על מהות ההבדל בין 2 הפטריות הם: פעילות האנזים GDH ורמת ה,ATP ב - rolfsii.s פעילות GDH יורדת בריכוז אמוניה של 1 מ"ג/ל' בעוד שב - lycopersici F.o..f sp. הפעילות ממשיכה גם בריכוז אמוניה של 86

94 15 מ"ג/ל'. רמת ה ATP משמשת כאן כמדד לפעילות מטבולית בתא: ב - rolfsii.s יש צריכה של ATP עד לריכוז של 0.4 מ"ג/ל' ולאחר מכן מתחילה הצטברות של ATP שיתכן ומקורה, הוא בהגברת תהליך הנשימה או ירידה במטבוליזם התאי (פעילות.(GDH לעומת זאת, יש צריכה של.(ATP בכל תחום ריכוזי האמוניה (ירידת ברמת ה.F.o.f sp. lycopersici ע"י ATP 5.6 מנגנון אפשרי לרעילות אמוניה אמוניה, אלקטרוליט חלש, נכנס לתאי הפטרייה באמצעות דיפוזיה פסיבית של המולקולה (1952 Danielli,.(Davson and באופן כללי, החדירות של אלקטרוליטים חלשים תלוייה במפל הריכוזים (1952 Beevers,.(Simon and התאים נראים גם חדירים לאמוניה בכיוון החוצה מהתא, ושיעור הכניסה או האיבוד תלוי בהבדלי הריכוזים בין הסביבה הפנימית והחיצונית (איור 25 מסלול 2). ניתן לזהות כניסה של אמוניה חופשית לתוך קורי הפטרייה, באמצעות מדידה של ה ph התוך תאי. מעבר האמוניה לתוך הקורים מעלה את ה ph התוך תאי כתוצאה מצריכה של פרוטונים חופשיים Montville,1990).(DePasquale and הפרשת הפרוטונים אל מחוץ לתא מתבצעת באמצעות משאבת הפרוטונים P-ATPase על חשבון הידרוליזה של ATP (1988 (Serrano,,1985 (איור 25 מסלול 4) ה. אמוניה החוץ תאית והפנים תאית יכולה להפוך לאמוניום ) 4 + (NH (השיווי משקל תלוי בעיקר ב- ph של התמיסה, לפי משוואת הנדרסון- הסלבלך: +.Log {NH 3(g) ]/[NH 4 (aq) ]} = ph עם המעבר לאמוניום נקבל עליה ב ph (איור 25 מסלול 1 ו 3). עליה בריכוז האמוניום התוך תאי יכול לגרום למעבר אמוניום אל מחוץ לתא (איור 25 מסלול 5) כפי שדווח בעבודה של Britto (2001) et al שבה חשיפה של שורשי שעורה לריכוז אמוניום חיצוני של 10, mm גרמה לעליה בשטף החוץ תאי של NH 4 + כנראה דרך תעלות בממברנה, על מנת להתמודד עם עודפי ה NH 4 בציטוזול (דהפולריזציה של הממברנה). סילוק עודפי NH 4 מהציטוזול דרש השקעת אנרגיה ואכן מצאו עליה של כ 40% בנשימת השורשים. העליה בנשימה לא הייתה קשורה למטבוליזם החנקן כפי שבדקו זאת עם (MSX) Methionine sulfoximine שמעכב הטמעה של +.NH 4 הגברת הנשימה גרמה להפחתה בשיעור הגדילה של צמחי השעורה. 87

95 NH 3 ph גבוה OH - OH - 4 ממבראנה H 2 O 1 2 OH - OH - 3 H + H + ph נמוך 5 NH OH - H + NH 3 + H + H + NH 4 + איור 25: השפעת חשיפה של תאי פטרייה לאמוניה/אמוניום ברמת התא הבודד והסביבה החיצונית. אמוניה יכול להמשיך ולחדור לתוך ממבראנת המיטוכונדריה, במטריקס של המיטוכונדריה הוא יכול להתחבר לפרוטון ולההפך לאמוניום (איור 26 מסלול 1). במטריקס של המיטוכונדריה פועל מעגל (tricarboxylic acid cycle) TCA (איור 27), המעגל הוא השלב השני בנשימה. הפעלת מעגל ה TCA מחייבת הובלה של הפירובט שנוצר בציטוזול בשלב הגליקוליזה (השלב הראשון בתהליך הנשימה, שבו הגלוקוז, מתפרק ל - 2 סוכרים תלת פחמניים, שמתחמצנים ומתארגנים מחדש ל 2 מולקולות של פירובט) דרך הממברנה הפנימית הבלתי חדירה של המיטוכונדריה. בהובלה זו משתתף נשא ייחודי של פירובט (מונוקרבוקסילט), המזרז חילוף של פירובט ו - OH דרך הממברנה הפנימית תוך שמירה על מאזן המטען החשמלי (איור 26 מסלול 2). המעגל מספק מס' מולקולות של,ATP אבל בעיקר כוח מחזר בצורת NADH ו 2 FADH שעוברים חמצון ע"י O 2 דרך שרשרת הנשימה ומספקים כמויות גדולות של ATP (איור 26 מסלול 4). תוצרי ביניים של מעגל זה מנוצלים לתהליכי ביוסינתזה (1952 al.,(krebs et במיוחד -α oxaloacetate ו (Wang et al., 1953) 27 מסלול (1 ליצירת גלוטמאט (איור ketoglutarate ליצירת אספרטט (איור 27 מסלול 2) ה. אנזים GDH גם הוא נמצא במטריקס של המיטוכנדריה ובאמצעותו ניתן לבצע את תהליך יצירת הגלוטמט: 2-Oxoglutarate + NH NAD(P)H --- Glutamate+H 2 O +NAD(P) + ATP --- ADP+P i מגלוטמט ניתן ליצור גלוטמין, אספרטט ואספרגין בשילוב אנזימים נוספים כמו גלוטמין סינתטז, אספרטט אמינוטרנספרז ו אספרין סינתטז. עלייה בריכוז החנקן האמוניקאלי עלולה לגרום לייצור מוגבר של חומצות אמינו ע"י פעילויות אנזימתיות שונות המערבות תיווך של מעגל TCA ויכולה להוביל לרקון חלק מהפחמן ממעגל ה 88

96 , TCA דבר שיצריך ראקציות משניות על מנת לספק פחמן החיוני לתפקוד המתמשך של מעגל TCA במהלך גדילה אקטיבית וביוסינתזה של חלבון. תאי טבק מסוגלים לגדול על אמוניה כמקור חנקן יחידי רק כאשר מוסיפים למצע הגידול:.succinate,malate, fumarate, citrate, α-ketoglutarate, glutamate or pyruvate נראה שתפקיד החומצות האורגניות לא קשור לתנועה של אמוניה או הקלה מרעילות אמוניה, אלא קשור לצריכה של שלדים פחמננים לסינטיזה של חומצות אמינו ) Mateles, Behrend and.(1976 איור 26: חתך אורכי של מיטוכונדריה (1985 (Douce, עודף הפרוטונים שנוצר במהלך סינתזת חומצות האמינו צריך להישאב החוצה מהמיטוכונדריה על מנת לשמור על ph פנימי קבוע (1985 al..(wiame et הגברת תהליך הנשימה (שרשרת העברת האלקטרונים מזרזת את זרימת האלקטרונים מ NADH ו 2 FADH לחמצן, מקבל האלקטרונים הסופי בתהליך הנשימה) (איור 26 מסלול 4) והעדר הסימטריה בעמדת נשאי האלקטרונים בממבראנה הפנימית של המיטוכונדריהן מאפשר העברת פרוטונים דרך הממבראנה במהלך זרימת האלקטרונים אל החלל הבין-ממברני (1995 Moore,.(Whitehouse and תשומת האנרגיה החופשית שיש להשקיע בהעברת פרוטונים דרך הממבראנה מתקבלת מהאנרגיה החופשית המשתחררת במהלך מעבר האלקטרונים (ייצור.(ATP 89