סקר ספרות

אלכוהול אצטיל טרנספרזות כמקור לשונות בארומה של תפוח מזני "גרני סמיט" ו"פוגי" עבודת-גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית של האוניברסיטה העברית בירושלים לשם קבלת תואר "מוסמך למדעי החקלאות" מגישה : ענבר ביז'ינסקי תאריך: דצמבר 2009

אלכוהול אצטיל טרנספרזות כמקור לשונות בארומה של תפוח מזני "גרני סמיט" ו"פוגי" עבודת-גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית של האוניברסיטה העברית בירושלים לשם קבלת תואר "מוסמך למדעי החקלאות" מגישה : ענבר ביז'ינסקי תאריך: דצמבר 2009 2

עבודה זו נעשתה בהדרכת ד"ר דורון הולנד וד"ר אפרים לוינסון ממרכז מחקר נווה יער, מנהל המחקר החקלאי. 3

תודות: אני מודה לד"ר דורון הולנד, לד"ר אפרים לוינסון ולכל משפחתי על התמיכה והעידוד לאורך כל הדרך הארוכה. עבודה זו מוקדשת לאבי, משה טל. 4

תוכן העניינים עמוד 7-9 10 11 12 12-13 13 13-14 14 14-15 15 15-16 16-17 17 17-18 18 18 19-20 21 21 21 22 22 22 22 23 23 23 תקציר. רשימת איורים וטבלאות. רשימת קיצורים. מבוא. 1. סקר ספרות. 2. התפוח. 2.1 חומרים נדיפים בצמחים. 2.2 חומרי ריח וטעם. 2.3 2.3.1 חומרים נדיפים בתפוח. חומרי ארומה בתפוח. 2.3.2 אסטרים. 2.4 ביוסינתזה של אסטרים. 2.4.1 משפחת.BAHD 2.5 משפחת אנזימי.AAT 2.6 אנזימי AAT בתפוח. 2.6.1 השערת המחקר. 2.7 מטרות המחקר. 2.8 3. חומרים ושיטות. רשימת חומרים ומקורם. 3.1 3.1.2 רשימת פריימרים. חומר צמחי. 3.2 דיגום. 3.2.1 הפקת RNA מרקמות התפוח שנדגמו. 3.3 סינתזת.cDNA 3.4 בידוד גנים ל AAT מתפוח. 3.5 ניתוח הרצפים שיטות ביואינפורמטיות. 3.6 בידוד גנים בעלי דמיון ל AAT מתפוח על בסיס סריקת ספרית.EST 3.7 הפרדת DNA על גבי ג'ל אגרוז. 3.8 ריבוי הגנים. 3.9 שיבוט הגנים AAT לפלסמיד ביטוי. 3.9.1 5

תוכן עניינים המשך. עמוד 23-24 טרנספורמציה לחיידקים. 3.9.2 24 ריבוי והפקת פלסמיד.)miniprep( 3.9.3 פעילות אנזימתית. 3.10 24 ביטוי הגנים בחיידקים. 3.10.1 24 ליזאט מתאי החיידקים. 3.10.2 25 ריאקציה אינזימתית עם סובסטראט מסומן רדיואקטיבית. 3.10.3 אנליזת נדיפים. 3.11 25 ריאקציה אנזימתית קרה. 3.11.1 25 בדיקת אסטרים במדיום החיידקים. 3.11.2 26 זיהוי נדיפים ב-.GC-MS 3.11.3 ביטוי הגן AATFUGS1 בשמרים. 3.12 26 שיבוט הגן AATFUGS1 לפלסמיד ביטוי ייחודי לביטוי בשמרים. 3.12.1 27 טרנספורמציה לחיידקים למטרות זיהוי וריבוי. 3.12.2 27 טרנספורמציה לשמר. 3.12.3 27 הפקת החלבון הרקוממביננטי מהשמרים. 3.12.4 27-28 ריכוז וניקוי החלבון. 3.12.5 28 ריאקציה אינזימתית עם סובסטראט מסומן רדיואקטיבית. 3.12.6 28 אנליזת נדיפים ב - GC-MS ראקציה אינזימתית קרה. 3.12.7 תוצאות. 4. 29-30 בידוד גנים בעלי הומולוגיה גבוהה ל AAT מתפוח. 4.1 31 רצף חומצות האמינו בגנים שבודדו בהשוואה לAAT ידועים מתפוח. 4.2 32 השוואת רצף חומצות האמינו של AAT שבודד מהזן פוג'י מרקמת קליפה העשירה באצטטים ל AAT שבודד מהזן גרני סמיט מרקמת ציפה ללא אצטטים. 4.3 33 שונות ברצף חומצות האמינו בגנים שבודדו בהשוואה לAAT פעילים מאורגניזמים שונים. 4.4 34-37 שימוש במסד נתונים של EST's מתפוח להגברת גנים בעלי דמיון ל AAT מתפוח ובדיקת ביטויים ברקמות התפוח. 5.4 38-39 הגברת הגן דמוי a.no CN578896 EST המכיל את האזור בו חסרות 12 ח.א 4.6 ביטוי פונקציונאלי של.AAT 4.7 4.7.1 בדיקת פעילות אינזימתית של חלבונים שהופקו משמרים 40 טרנסגנים לקלון. AATFUGS1 40 4.7.2 ספציפיות האנזים AATFUGS1 לסובסטרטים אלכוהוליים שונים וריכוזים שונים. 6

תוכן עניינים המשך. עמוד 41 41 42 42 43 43-44 44 44-45 45-46 46 47 47-48 49-54 55-61 62-64 4.7.3 ניסיונות לביטוי פונקציונאלי שלAAT. 4.7.3.1 ניסיונות לביטוי פונקציונלי בחיידקים. ניסיונות לביטוי פונקציונלי בשמרים שלמים. 4.7.3.2 5. דיון ומסקנות. בידוד גנים ל AAT מזני התפוח גרני סמיט ופוג'י. 5.1 הבדלים ברצף הראשוני של גנים ל.AAT 5.2 הבדלים ברצף הראשוני של גנים ל AAT מתפוח מזן גרני סמיט. 5.3 הבדלים ברצף הראשוני של גנים ל AAT מתפוח מזן פוג'י. 5.4 השוואה בין גן ל AAT שבודד מרקמה עשירה באצטטים לגן 5.5 שבודד מרקמה ללא אצטטים. איתור EST's בעלי דמיון לגן AAT ממאגרי מידע קיימים של תפוח. 5.6 פעילות האנזים AAT מתפוח בחיידקים טרנסגנים. 5.7 פעילות האנזים AAT מתפוח בשמרים טרנסגנים. 5.8 ספציפיות האנזים לסובסטרטים אלכוהוליים והשפעת ריכוז 5.9 הסובסטרט האלכוהולי על פעילות האנזים. סיכום. 5.10 נספחים. 6. רשימת ספרות. 7. פרק באנגלית. 8. 7

תקציר התפוח התרבותי Borkh.( )Malus domestica שייך למשפחת הורדניים )Rosaceae( ולתת משפחת התפוחיים.(Maloidea) זני התפוח רבים ומגוונים ומציגים שונות רבה המתבטאת גם בתכונות הפרי כגון גודל, צבע, בשלות וטעם. טעם פרי התפוח מושפע מסוכרים, חומצות, טאנין, אסטרים וחומרים ארומטים. טעמו הטוב של התפוח מוענק לו בעיקר ע"י אסטרים נדיפים. סינתזת האסטרים מקוטלזת ע"י האנזים )AAT( Alcohol acetyl transferase המעביר קבוצת אציל לסובסטראט אלכוהולי ליצירת אסטר. בעבודה זו נבדק האם ההבדל בארומה בין תפוח ארומאטי מזן פוג'י לתפוח בעל ארומה מועטה מזן גרני סמיט מקורו בגנים המקודדים לאנזימים המקטלזים סינתזת אצטטים מקבוצת ה- Alcohol acetyl.)aat( transferase בשלב ראשון בודד mrna מרקמות התפוח הנבדקות ונמצא כי רצפים הומולוגים ל AAT's ידועים, קיימים בקליפה ובציפה של תפוח מזן גרני סמיט ותפוח מזן פוג'י והם מכילים את האזורים השמורים המאפיינים גנים ממשפחת,BAHD אליה משתייכים.AAT's בשלב השני נעשתה השוואה בין רצפי חומצות האמינו)ח.א( המוסקים מרצף הנוקלאוטידים של הגנים שבודדו מזני התפוחים פוג'י וגרני סמיט ונמצא כי קיימים הבדלים ברצף. ההבדלים נמצאו גם בגנים שהתבטאו בקליפה וגם בגנים שהתבטאו בציפה. כמו כן נמצאו הבדלים בגנים המתבטאים בקליפה ובציפה של אותו הזן. חלק מההבדלים שנמצאו ייחודיים לרצף מרקמה מסוימת ואינם מופיעים ברצפים אחרים ידועים של.AAT בהשוואת הרצף הראשוני של חומצות האמינו המוסקות מהגן המקודד לAAT שבודד מהציפה של זן התפוח גרני סמיט, חסרת הארומה, לבין הגן שבודד מהקליפה של אותו הזן ובה ארומה מועטה, נמצא הבדל של חומצה אמינית אחת. בגן המתבטא בציפה ח.א. מס' 26 היא גליצין )G( לעומת ח.א. גלוטמאט ל- G המופיעה בגן המתבטא בקליפה. ייתכן כי השינוי הבודד הזה בחומצת אמינו מס' 26 מ- E )E( בציפת הזן גרני סמיט, גורם לחוסר הפעילות של AAT בציפה לעומת פעילות בקליפה. בכל הAAT הידועים מתפוח, פרט ל AAT מציפת הזן גרני סמיט, חומצת האמינו מס' 26 היא -E. בגן ל AAT שבודד בעבודה הנוכחית מרקמת קליפה של זן התפוח פוג'י נמצאו ארבע הבדלים ייחודיים בחומצות האמינו שאינם מופיעים ב AAT אחרים ידועים מתפוח. השינויים הייחודיים בחומצות האמינו ברצף הן היסטידין ( ח.א מס' 252(, ליזין ( ח.א מס' 280(, היסטידין ( ח.א מס' 300( ותראונין ( ח.א מס' 317(. השינוי ברצף חומצות האמינו אינו באתר הידוע כשמור או באתר הפעיל אולם תפוח מזן פוג'י נחשב עשיר בארומה. ייתכן וארבעת השינויים הייחודיים לרצף חומצות האמינו ברצף הגן שבודד מקליפת תפוח פוג'י משפיעים על ייצור הארומה החזקה המאפיינת את הזן לעומת זנים אחרים. בקליפת תפוח מהזן פוג'י, נוצרים מספר סוגים של אצטטים ובכמות גדולה לעומת ציפה של תפוח מהזן גרני סמיט שלא נוצרים בה אצטטים. בהשוואת רצף חומצות האמינו מגן הומולוגי לAAT שבודד מרקמת קליפה של תפוח פוג'י לרצף חומצות אמינו מגן הומולוגי ל AAT שבודד מציפת תפוח גרני סמיט נמצא הבדל של 14 חומצות אמינו. ייתכן והבדל של 14 חומצות אמינו הוא הגורם או אחד הגורמים 8

להבדל בין אנזים פעיל וייצור אצטטים בקליפת תפוח מזן פוג'י, לבין אנזים לא פעיל וחוסר אצטטים בציפת תפוח מזן גרני סמיט. בהנחה כי יש יותר מאנזים אחד של AAT ברקמת התפוח, נבדק Database של EST מתפוח המכיל למעלה מ. EST's 300000 בבדיקה זו נמצאו, בנוסף לארבעת הרצפים בעלי הומולוגיה גבוהה לAAT, רצפים ל AAT בדרגת זהות נמוכה יותר מהרצפים שבודדו בעבודה זו. נמצא כי גן דמוי EST a.no 882727CN אינו מתבטא בכל זני התפוח שנבדקו בעבודה זו אלא רק בגרני סמיט. בנוסף, קיימים עוד 23 הבדלים ייחודיים לגן דמוי a.n 882727CN EST שאינם מופיעים ברצף המקודד ל AAT ידועים מתפוח. ההבדלים המשמעותיים ברצף של ה- EST מרמזים על כך ש a.no 882727CN EST הוא חלק מגן המקודד לאנזים שונה באופן מהותי משאר אנזימי AAT שנמצאו בתפוח מזן גרני סמיט. בגן דמוי a.no CN578896 EST המתבטא בציפת התפוח פוג'י ובקליפת התפוח גרני סמיט נמצא חסר של 12 ח.א באזור 290 ברצף בהשוואה לרצף AAT ידוע מתפוח. נראה כי a.no CN578896 EST מקודד לאנזים נוסף, שונה, הנמצא בציפת תפוח מזן פוג'י ובקליפת תפוח מזן גרני סמיט. סביר להניח כי חוסר של 12 ח.א משפיע על פעילות האנזים אולם השפעת החסר לא ברורה. בעבודה זו בחנוAAT מתפוח בשמרים טרנסגנים. הפעילות האנזימתית של שמרים המכילים את גן הומולוגי ל AAT שבודד מקליפת תפוח מזן פוג'י )AATFUGS1( נבדקה עם סובסטרטים אלכוהולים שונים. נמצא כי אכן קיימת ומתרחשת יצירת אצטטים גדולה יותר בשמרים הטרנסגנים בהשוואה לשמרים לא טרנסגנים אשר אינם מבטאים את הגן.AATFUGS1 לסיכום, בעבודה זו בודדו ארבעה גנים שלא היו ידועים עד כה מרקמות קליפה וציפה של תפוחים מזן פוג'י וגרני סמיט. הראנו כי יש מס' גנים בעלי רצף ראשוני של AAT באותו הזן, גנים דומים אך לא זהים. בנוסף אותרו בזני התפוח הנבדקים גנים נוספים בדרגת זהות נמוכה יותר מהגנים שבודדו בעבודה זו והראנו שגן נוסף מתפוח שלא היה מוכר עד כה והוא שונה מגנים שפורסמו, מראה פעילות של AAT בשמרים טרנסגנים. עבודה זו התמקדה ברצף הראשוני ובניסיון לבטא את הגנים במערכות הטרולוגיות )חיידקים ושמרים(. הנתונים שנאספו עד היום מראים שונות הקיימת ברצף הראשוני של הגנים המקודדים ל AAT מתפוח הן באותו הזן והן בין זנים שונים אולם הם אינם מספיקים עדיין להסברת מודל הארומה בתפוח ולא ניתן עדיין לקבוע מה הן הסיבות המולקולריות לשונות הגדולה שאנו רואים בין זני תפוח שונים. ממצאים מעבודה זו חיוניים להבנת השאלות האלו ומהווים בסיס מוצא להמשך ברור שאלת מקור השונות. 9

רשימת איורים איור 1: ביוסינתזה של אצטטים. איור : 2 מיקום הפריימרים יחסית לגן AAT ידוע מתפוח. איור : 2.1 מפת הפלסמיד.pPIC9k איור 3: הגברת מקטעי cdna של הגן AAT מתפוח. איור 3.1: השוואת רצפי חומצות אמינו שבודדו בעבודה זו לרצפים ידועים. איור 3.2: השוואת רצף חומצות האמינו המקודדות ע"י AATGRANF1 ל.AATFUGS1 איור 4: השוואת רצפי חומצות האמינו שבודדו בעבודה זו לרצף חומצות האמינו שלAAT מאורגניזמים שונים. פעילים איור : 5 תוצאות השוואת גן ל AAT ידוע מתפוח ( CAC09064 (accession no. באמצעות תוכנת איור 6: ההומולוגיה.Blast על בסיס הרצף הידוע של הEST's RT-PCR.(accession no AT000407( איור 6.1: על בסיס הרצף הידוע של הEST's RT-PCR.(accession no. CN882727(.(accession no. CN578896( איור 6.2: הגברת מקטעי cdna של ה EST's איור 7: מיקום ה EST's יחסית לגן AAT השלם. איור 8: השוואת רצף חומצות האמינו של a.no. CN882727 EST לגנים המקודדים ל.AAT איור 9: השוואת רצף AAT מתפוח לרצף.a.no. CN578896 EST איור 10: השוואת רצף הגן AAT ל EST בו חסרים. 36bp איור 11: תוצרי הגברת מקטע הגן.a.no. CN578896 EST המכיל חסר. איור 12: פעילות אנזימתית ממיצוי חלבון משמרים. רשימת טבלאות טבלה 1: רשימת פריימרים. טבלה 2: סיכום ההבדלים ברצף חומצות האמינו של הגנים שבודדו. טבלה 3: סיכום הרצפים שבודדו בעבודה זו ברקמות התפוח. 0

AAT Alcohol acetyl transferase a.no- accession no. Bis-Tris- 2,2-bis(hedroxymethyl)-2,2',2"-nitrilotriethanol BMGY-Buffered Glycerol-complex Medium BMMY- Buffered Methanol-complex Medium bp-base pairs C- degree Celsius DNA-Deoxyribonucleic acide E. coli-escherichia coli EDTA-Ethylene diamine tetra acetic acid EST-Expressed sequence tag fkat-femtokatal (= femtomole/second) GC-MS-Gas chromatography mass spectrometry IPTG-Isopropyl β D thio galctopyranoside M-molar mg- milligram MGY-Minimal glycerol medium mm-millimolar PCR-polymerase chain reaction SPME-Solid phase micro extraction µg-microgram µl-micro liter רשימת סמלים וקיצורים ד'- דקות ח.א- חומצת אמינו טמפ'- טמפרטורה מ"ל- מיליליטר ש'- שעה שנ'- שנייה 1

1.מבוא החקלאות המודרנית הביאה לפיתוחם של אלפי זנים חדשים. השבחת הזנים התמקדה בעיקר בפיתוח תכונות אגרונומיות רצויות ע"י המגדל והצרכן כגון הגברת יבול, מתן עמידות בפני מזיקים ומחלות, עמידות בתנאי הסביבה, שיפור צבע גודל וצורת הפרי או הירק והארכת חיי המדף. בחלק מהזנים המשופרים החדשים נפגעו תכונות המשפיעות על הארומה המהווה מרכיב חשוב ב"טעם המלא" )flavor( של המזון, ( 2001.)Lewinsohn, בעיית הפגיעה בארומה הינה כללית וקיימת במרבית הפירות והירקות. על מנת ליצור זנים חדשים איכותיים וארומאטיים יש צורך בהבנת המנגנון המייצר ארומה בפרי, אפיון פעילותם של האנזימים המקטלזים את יצירתם של החומרים הארומאטיים וזיהוי הגנים המעורבים בתהליך על מנת להתגבר על הבעיה באמצעות מניפולציות גנטיות. קיימים זנים רבים של תפוחים, השונות בין הזנים היא רבה ומגוונת. שונות בגודל, בצבע, במרקם וכן בטעם ובארומה. ישנם זנים הנחשבים עניים בארומה וישנם זנים ארומאטיים מאד. במחקר זה נבדקו גנים הקשורים לתהליך יצירת הארומה בתפוח עני בארומה לעומת תפוח ארומאטי. 2.סקר ספרות התפוח 2.1 התפוח התרבותי Borkh.( )Malus domestica שייך למשפחת הורדניים )Rosaceae( ולתת משפחת התפוחיים (Maloidea).(Challice (1974 מעריכים כי התפוח נוצר מאלופוליפלואידיות,גנום התפוח הוא דיפלואידי עם בסיס האפלואידי של 17 כרומוזומים )X=17(. הגודל של גנום התפוח מוערך ב- Mb Malus מוצא התפוח התרבותי הוא ממין הבר.)Arumuganathan and Earle, )1991 743-796, sieversii המגיע ממרכז אסיה ( 1999 al., (Geibel et. עץ התפוח הוא עץ נשיר של האזור הממוזג. גובהו משתנה החל מגובה של שיח ועד 15 מטרים. בתנאי הגידול של הארץ הוא מגיע לגובה של 3-5 מטרים. עץ התפוח נושא חלק גדול מפרותיו על גבי דרבנות. הדרבנות מתחילים להניב בגיל 2-3 שנים ובד"כ מתנוונות כעבור 10 שנים. בתנאי הארץ התפוח פורח סמוך ללבלוב, עונת הפריחה בזנים העיקריים היא מסוף מארס ועד אמצע מאי. טעם פרי התפוח מושפע מסוכרים, חומצות, טאנין,אסטרים וחומרים ארומטים. טעמו הטוב של התפוח מוענק לו בעיקר ע"י אסטרים נדיפים של חומצות שומניות ושל חומצות אמינו. ( אסף גור ושותפיו- 1962 (. התפוח הוא פרי קלימקטרי, כמות מרכיבי הטעם בפרי התפוח עולה עם עליה באוטוקטליזה של האתילן )2000 al.,.)fellman et התפוח מזוהה ע"י הצרכן עקב טעמו, תרומתו לבריאות והרכב המינרלים שבו, ועל כן התפתח לגידול תרבות נרחב שפרותיו נסחרים בכל העולם )2006 al.,.)newcomb et התפוח הוא אחד הגידולים הנפוצים ביותר בעולם ( 2009,)Seo and Kim הסחר העולמי בתפוח טרי שולש משנת 1970 ועד 1995 והגיע ל- 5 מיליון טונות. בארצות הברית, יצוא התפוח גדל במאות אחוזים בין השנים 1996 ל- 1997 והגיע ל- 5.9 מיליון טונות, הרווח מגידול מסחרי של תפוח בשנת 1996 עמד על 1.7 בליון דולר al.,1997(.)krissoff et 2

בישראל, בשנת 2007 מטעי התפוח נטועים על פני 39,700 דונם והתפוקה החקלאית של תפוח עץ נאמדת ב- 101,200 טון. יבוא תפוח טרי נאמד ב 3,829 טון )על פי הלשכה הישראלית לסטטיסטיקה(. 2.2 חומרים נדיפים בצמחים צמחים מייצרים מגוון של נדיפים. החומרים הנדיפים בצמחים הינם מולקולות ליפופיליות בעלות משקל מולקולרי נמוך ובעלות לחץ אדים גבוה הממלאות מגוון תפקידים אקולוגיים ומסייעות במגוון פעילויות ביולוגיות 2008( al..)pichersky et al., 2006; Zhu et צמחים מסנתזים מגוון גדול של נדיפים אורגניים. הקבוצות העיקריות של הנדיפים האורגניים כוללות את הטרפנואידים, חומצות שומן וניגזרותיהם, בנזואיד ופניל פרופנואיד. 2005( al.,.)knudsen et al., 2004; Gang et בין תהליכי סינתזה של נדיפים מעורבים תהליכי חימצון, הידרוקסילציה, מתילציה, אצילציה והסרה של קבוצות ליפופיליות )2006 al.,.)pichersky et מספר רב של גנים המקודדים לאנזימים המסנתזים נדיפים, דווחו לאחרונה. ביניהם שלוש משפחות גנים חשובות, המעורבות בייצור ובמטבוליזם של נדיפים: משפחת המתיל טרנספרזות,)O-methyltransferases( משפחת האציל טרנספרזות )terpene synthase( ומשפחת הטרפן סינתז )acyltransferases( )2005 Gang, Dudareva (.הנדיפים et al.,2004; מופרשים מכל חלקי הצמח, מחלקים וגטטיביים, מפרחים, מפירות ואף משורשים. 2004( al.,.)knudsen et al., 2004 ; Steeghs et בעוד שחלק מהנדיפים נפוצים כמעט בכל הצמחים ישנם נדיפים ייחודיים למספר קטן של קבוצות טקסונומיות.)Pichersky and Gershenzon, 2002( לנדיפים יש מספר תפקידים בצמח. נדיפים המופרשים מפרחים ומפירות מושכים מאביקים פוטנציאלים ומפיצי זרעים, נדיפים המופרשים מהצמח כתגובה לפגיעה או פציעה ע"י אוכלי צמחים, מושכים פרוקי רגליים הטורפים את אוכלי הצמחים, נדיפים בעלי תכונות אנטי מיקרוביאליות המופרשים מהצמח דוחים או מרעילים מזיקים ופתוגנים ובכך מהווים הגנה ישירה לצמח DeMoraes et al., 2001; Friedman et al., 2002; Pichersky and Gershenzon, 2002; (.)Hammer et al., 2003 2.3 חומרי ריח וטעם הטעם השלם מוגדר כשילוב של טעם וריח )1987 )Thomson, או כשילוב של חוש הטעם, חוש הריח וחוש המישוש (2001.(Lewinsohn, חוש הטעם של האדם מוגבל לתחושה של ארבעה טעמים: מליחות, מתיקות, חמיצות ומרירות. טעמים אלו מורגשים ע"י בלוטות הממוקמות בלשון (2001.(Lewinsohn, הניחוחות הינם מרכיבים כימיים נדיפים הנישאים באוויר הפתוח ומגיעים לאברים אפיתליים הקשורים לחוש הריח בחלל האף של האדם )1991 Axel,.)Buck and באמצעות חוש הריח ניתן להבחין בין אלפי ריחות שונים גם כשריכוז המולקולות נמוך מאד. חוש המישוש של המזון מתאפשר באמצעות העצב הטריגמינלי )העצב התחושתי של הפנים( בעזרתו אנו חשים את הטמפ' 3

והמרקם של המזון (2001.(Lewinsohn, מאז שחר האנושות משתמשים בצמחים כמגבירי טעם וניחוח, צמחים המשמשים כצמחי תבלין וטיבול הם בד"כ בעלי ארומה חזקה. סינתזת חומרים כימיים המאפשרים ארומה הופכת נפוצה מאד. השוק העולמי של חומרי טעם וארומה מוערך ב- 18 בליון דולר ( Guentert,.)2007 הכימיקלים הארומאטיים הינם מרכיבים אורגניים המיוצרים ע"י תהליכי סינתזה אורגניים או ביוקטליטים, או ע"י בידוד מתהליכי תסיסה מיקרוביאליים )2008 al.,.)schwab et ארומת פירות מאופיינת במורכבות, במיוחד בגלל מספר התהליכים והמסלולים המעורבים, בכמות המטבוליטים הסופיים והגורמים המווסתים אותם )2005 al.,.)defilippi et 2.3.1 חומרים נדיפים בתפוח פרופיל הנדיפים בפרי התפוח מכיל מרכיבים רבים וביניהם אסטרים, אלכוהולים, אלדהידים, קטונים, טרפנים ואחרים ( 1999; al., Dimick and Hoskin, 1983; Berger et al., 1991; Hewett et al., 2008.)Holland et al., 2005; Yanmin et יותר מ- 300 מרכיבים נמדדו בפרופיל הנדיפים בתפוח. למרכיבים אלו טווח רחב של מופעים, אולם, האסטרים מהווים 78-92% מכלל הנדיפים הנוצרים במהלך הבשלת התפוח ומהווים את המרכיב הגדול ביותר התורם לארומת התפוח 2008) al., Flath (.המרכיב et al., 1967; Paillard, 1990; Yanmin et השני בגודלו הינו הכוהלים ותרומתם היא של 6-16% למרכיב הארומה בתפוח )1990.)Paillard, האסטרים הנדיפים שבפרי התפוח קשורים לאיכות התפוח ומשפיעים על בחירת הצרכן. בזני התפוח השונים קיימת שונות בכמות ובאיכות של ייצור הנדיפים. הביטוי השונה של ייצור הנדיפים כנראה נובע מגנוטיפ הצמח 2008( al.,.)fellman et al., 2000; Holland et al., 2005; Yanmin et בין אנזימי המפתח המייצרים חומרים נדיפים בתפוח נמצא האנזים אלכוהול אצטיל טרנספרז )AAT) acyltransferase) )alcohol המקטלז את השלב האחרון ביצירת האסטרים.)Beekwilder et al.,2004( 2.3.2 חומרי ארומה בתפוח פיתוח ארומה וסינתזת מרכיבי ארומה נדיפים קשורים לתהליך ההבשלה בפרי התפוח )2003 al.,.)echeverr'ia et בתפוח מרכיבי הארומה האופיינית הם אסטרים נדיפים, המתפתחים במהלך ההבשלה, כגון 2 -מתיל בוטיל אצטט, בוטיל אצטט, הקסיל אצטט ואתיל בוטנואט,.(Echeverria et al., 2004; Defilipi et al., 2005; Holland et al., 2005( האנזימים האחרונים במסלול הביוסינתתי לייצור אסטרים נדיפים בתפוח הם AAT 2005( al.,.)beekwilder et al., 2004; Holland et ההבדלים בין האסטרים הנדיפים והתרומה של אנזימי AAT לייצור הנדיפים בזני התפוח השונים עדיין לא ברורים. האסטרים הבולטים בפרי התפוח הם בוטיל אצטט ו 2- מתיל בוטיל אצטט המיוצרים בשפע ונחשבים כנותני ארומה אופיינית לתפוח 4

)2008 al.,.)sugimoto et ישנם הבדלים איכותיים וכמותיים בין חומרי טעם וארומה בזנים השונים של התפוח, כמו גם הבדלים במגוון האסטרים ובכמותם בין הקליפה לציפה באותו הזן Holland et (.)al.,2005 בתפוחים מהזנים פוג'י )Fuji( וגרני סמיט Smith( )Granny נמצא הבדל בפרופיל הנדיפים Holland et ( הזן גרני סמיט נחשב עני באסטרים נדיפים ולכן גם עני בארומה.(Holland et al., )2005 al., 2008.)al., ;2005 Zhu et תפוח מהזן פוג'י נחשב עשיר בארומה, בקליפת תפוח פוג'י נמצאו יותר סוגים של אצטטים ובכמות גדולה יותר לעומת האצטטים שנמצאו בציפה. בקליפת תפוח מסוג גרני סמיט נמצאו מעט אצטטים בעוד שבציפה כמעט ולא נמצאו אצטטים )2005 al., (. Holland et בתפוח מזן פוג'י ייצור האסטרים מוגבר במהלך התפתחות והבשלת הפרי והם התורמים הגדולים ביותר לארומה 2004( al.,.)echeverria et 2.4 אסטרים האסטרים הנדיפים נוצרים במיני פירות רבים במהלך ההבשלה ותורמים הן למשיכת בע"ח והן כחומרי הגנה מפני פתוגנים )2004 al.,.)beekwilder et האסטרים נוצרים גם בחלקי צמח וגטטיביים באופן רציף או כתגובה למצב עקה )2001 al., )Matticacci et ומהווים מרכיב בניחוח פרחים )Pyrus communis( אגס,)Malus domestica( בפירות כמו תפוח.)Dudareva et al., 1998( ובננה sapientum(.)musa האסטרים הנדיפים מהווים את המרכיב העיקרי בארומה,.)Yahyaoui et al., 2002; Beekwilder et al., 2004; Sugimoto et al., 2008( לעיתים קרובות פרי מזן מסוים מפריש טווח רחב של אסטרים. לדוגמא, בפרי תות בשל נמצאו למעלה מ- 100 אסטרים שונים )1997 Holden,.)Zabetakis and לרוב האסטרים הנדיפים יש מאפייני טעם המוגדר כפירותי )2002.)Burdock, 2.4.1 ביוסינתזה של אסטרים אסטרים מיוצרים ברקמת הפרי כתוצאה מתהליך אסטריפיקציה של אלכוהולים, חומצה קרבוקסילית ואציל- CoA בנוכחות חמצן )1983 Berger,.)Drawert and שילוב בין אלכוהולים שונים לאציל ייקבע את הצורה של האסטר האופיינית למיני פירות. במחקרים שבדקו את פעילותAAT Co-A בבננה, מלון, תפוח ותות נמצא כי קיים קשר בין נוכחות סובסטרטים אלכוהוליים ספציפיים, לסוגי האסטר הנוצרים בכל פרי )2004 al.,.)defilippi et הקודמנים הנפוצים ביותר של אסטר הם ליפידים וחומצות אמינו. מטבוליזם של קודמנים אלו במהלך ההבשלה משפיע ישירות על הכמות והסוג של האסטר שייווצר )2004 al.,.)beekwilder et גורם מגביל נוסף של ייצור האסטר הוא ריכוז האלכוהול המהווה קודמן לייצור אסטר. האלכוהול כגורם מגביל לייצור אסטר מצביע על כך שייתכן וסינתזת האסטרים מווסתת בשלב הפעילות האנזימתית של ADH או/ו Defilippi et al., ;2004 ( LOX al., 2005 Defilippi (.במחקר et שפורסם לאחרונה (2008 al., (Sugimoto et דווח כי עליה וירידה בביטוי גנים לבטא- אוקסידאז,)β-oxidation( חמצון חומצות שומן oxidation(,)fatty-acide 5

ומטבוליזם של שרשראות חומצות אמינו מסועפות מתאים לעליה וירידה בייצור האסטר בתפוח. תבנית דומה נמצאה גם לגביי ביטוי הגנים,AAT,ADH ו-.LOX בפירות קלימקטרים ההורמון הגזי אתילן קשור לתהליכי ההבשלה. עיכוב ההורמון אתילן בפרי גרם להפחתה בכמות האסטרים הנדיפים בתפוח al.,2002(.)fan et al., ;1998 Lurie et כמו כן נמצא שכמות הנדיפים בפרי התפוח עולה עם העלייה באתילן ובקצב הנשימה עד לשיא הקלימקטרי. לאחר השיא הקלימקטרי כמות הנדיפים יורדת בהדרגה (2008 al.,.(sugimoto et עדיין לא ברור אם האנזימים הקשורים למרכיבי הארומה מתבטאים באופן תמידי או מתחילים להתבטא בשלב הקלימקטרי )2004 al.,.)defilippi et 2.5 משפחת BAHD משפחת BAHD היא משפחת על של גנים מסוג אציל טרנספרז. גנים ממשפחה זו מנצלים קבוצתCoA thioesters לייצור מגוון מטבוליטים בצמחים. שמה של משפחת BAHD נקבע על פי האות הראשונה של ארבעת החלבונים הראשונים שבודדו וזוהו המקודדים לאנזימים במשפחה (Pierre and De Luca, (2000. אנזימים אלו כוללים שני אנזימי אצטיל-טרנספרז, אנזים בנזיל-אלכוהול ואנזים O -אצטיל טרנספרז מהפרח קלרקיה breweri(.)dudareva et al., )1998,)Clarkia ידועים יותר מ- 46 גנים השייכים למשפחת ה BAHD- ולאחרונה זוהו עוד 70 גנים מגנום הארבידופסיס, השיכים למשפחת.)Ma et al., 2005; D'auria, 2006 ( BAHD האנזימים ממשפחת BAHD מראים לעיתים קרובות, טווח סובסטראטים רחב הן לקבוצת ה CoA והן לקבוצת האלכוהול. במקרים כאלו סוג התוצר הנוצר ברקמה תלוי יותר בריכוז הסובסטראט מאשר בערכי ה - m K או ה- K cat של האנזים לסובסטרטים אלו.) Beekwilder et al., 2004; Boatright et al., 2004( לאנזמים ממשפחת ה- BAHD מבנה של מונומר אחד ומסה מולקולרית של 48-55. kd מספר חומצות האמינו בחלבון המקודד מאנזימי BAHD הוא 445 בממוצע ונראה שהאנזימים ממשפחת ה- BAHD ממוקמים בציטוזול )2005 al.,.)ma et גנים ממשפחת BAHD מראים דמיון ברצף שנע בין 23% ליותר מ 2006( 90% al.,.)boatright et al., 2004; Ma et לכל הגנים במשפחת BAHD יש שני מוטיבים שמורים ברצף חומצות האמינו. המוטיב הראשון,,HXXXD ממוקם במרכז החלבון, כנראה באזור האתר הפעיל. המוטיב השני,,DFGWG נמצא באזור הקצה הקרבוקסילי של החלבון 2005( al.,.)st-pierre and De Luca., 2000; Souleyre et מחקרים הראו שחוסר במוטיבים הנ"ל, אחד או שניהם, מפחיתים משמעותית את פעילות האנזים, ( al., Suzuki et al., ;2003 Bayer et 2004 (.לאחרונה תואר לראשונה מבנה החלבון השלם של אנזים ממשפחתBAHD, האנזים וינורין- סינתז ( synthase,)vinorine שהוא אצטיל טרנספרז מהצמח.Rauwolfia serpentina נמצא כי לאנזים מבנה כללי המכיל ארבע עשרה גדילי בטא )β-strands( ושלוש עשרה סלילים.)helices( החלבון מורכב משני מוטיבים דומים בגודלם המחוברים ביניהם ע"י טבעת. האתר הפעיל של וינורין סינתז HXXXD ממוקם בתעלה /ערוץ העובר דרך המולקולה של החלבון בין שני המוטיבים. 6

חומצת האמינו היסטידין שבאתר הפעיל ממוקמת במרכז התעלה באופן שמאפשר גישה משני צדדי התעלה. הסובסטראט והליגנד יכולים להתחבר לאתר הפעיל משני הכיוונים של האנזים ללא תלות ביניהם.)Ma et al., 2005( 2.6 משפחת אנזימי AAT אלכוהול אצטיל טרנספרז,)AAT( הוא אנזים המקטלז את השלב האחרון בביוסינתזה של אסטרים נדיפים 2004( al., Miki (.אנזימי et al., 1985; Beekwilder et Alcohol Acyl )Beekwilder et al., )2004 מעבירים קבוצת אציל לסובסטראט אלכוהולי,(AAT(Transferase )איור 1(. ישנם אנזימי AAT ממקורות שונים. אנזימים אלו, על אף היותם מקטלזים תגובות דומות, הם בעלי שונות ברצף. לרוב אנזימי ה- AAT ממקור צמחי, משקל מולקולרי של 50 KDa ושני מוטיבים שמורים ברצף חומצות האמינו. המוטיב הראשון,,HXXXD ממוקם במרכז החלבון, כנראה באזור האתר הפעיל. המוטיב השני,,DFGWG נמצא באזור הקצה הקרבוקסילי של החלבון ותפקידו אינו ברור. המוטיבים השמורים ברצפי ה AATs- השונים, מפירות שונים, משייכים אותם למשפחת האציל טרנספרזות.)St-Pierre and De Luca, 2000; Souleyre et al., 2005 ) BAHD הוצע שישנם מספר אנזימים שונים ממשפחת ה- AAT הקובעים את הרכב האסטרים הנדיפים בפירות שונים )2005 al.,.)el-sharkawy et בפרי המלון ).L (Cucumis melo נמצאו עד כה ארבעה גנים שונים המקודדים ל- AATs, )Cm-AAT1, Cm-AAT2, Cm-AAT3, Cm-AAT4 ( גנים אלה דומים אך בעלי שונות ברצף חומצות האמינו )על פי רצף הנוקלאוטידים( וזיקה שונה לסובסטרטים אלכוהוליים. שלושה מאנזימים אלו הראו פעילות בשמרים טרנסגניים, שביטאו גנים אלו ואילו לאנזים הרביעי Cm-( )AAT2 לא נמצאה פעילות כלל. חוסר הפעילות של האנזים המקודד ע"י Cm-AAT2 נבע מהחלפה של חומצת אמינו מס' 268 טראונין ב- אלנין ברצף חומצות האמינו )2005 al., (. El-Sharkawy et O O R-CH 2 OH + CoA S C CH 3 AAT R-CH 2 O C CH 3 + CoA SH איור 1: ביוסינתזה של אצטטים. מקרה פרטי של אסטר בו קבוצת אצטיל מועברת לסובסטרט האלכוהולי. התגובה מקוטלזת ע"י האנזיםAAT. 2.6.1 אנזימי AAT בתפוח סביר להניח שלאנזימי AAT תפקיד חשוב בקביעת הארומה בתפוח. עדיין לא ידוע אם אנזים אחד של AAT אחראי לייצור טווח האסטרים המיוצרים בתפוח או שישנם כמה סוגים של AAT המעורבים בתהליך al.,2005(.)holland et ביטוי AAT משתנה בין זני התפוחים. בתפוח מזן 'גולדן דלישס' Delicious'.( )'Golden זוהו ארבע גנים של AAT שביטויים היה חזק יותר מאשר בתפוח מזן 7

גרני סמיט (2008 al.,.)zhu et בתפוח מזן 'רויאל גאלה' Gala'( )'Royal אותר גן המקודד ל- AAT וכונה.MpAAT1 האנזים יכול לנצל טווח רחב של סובסטרטים אלכוהולים ושלCo-A's MpAAT1 מותמרים שונים ליצירת האסטרים בתפוח. הזיקה של MpAAT1 לסובסטרטים מסוימים משתנה בהתאם לריכוזם ולמותמרים של ה-.(Souleyre et al.,2005) Co-A's כלומר גם לריכוז ולמותמרים של הסובסטרט השפעה על הארומה של התפוח מזן רויאל גאלה. גן המקודד ל- AAT בודד מתפוח מזן גולדן דלישס וכונה.MdAAT2 ל- MdAAT2 משקל מולקולרי של kda 47.9 והוא ממוקם בעיקר בציטופלזמה של תאי קליפת התפוח. יתכן כי MdAAT2 נמצא גם בממברנה של האורגנלה ( al., Li et Databast בתוך ה EST's ;2006 2007 al.,.)li et בנוסף נעשו מתפוח מזן רויאל גאלה כ 300000 שנבנה )http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi( נמצאו ארבעה רצפים הומולוגים ל.AAT 2.7 השערת המחקר: השערת המחקר היא שחלק ניכר מהארומה של התפוח, מקורו בפעילות שלAATs. ההבדלים בארומה בין זני תפוח שונים בכלל ובפרט בין הזן פוג'י ו-גרני סמיט וכן בין הקליפה והציפה של אותו הזן, מקורם בגנים שונים המקודדים ל- AAT או/ו מהתבטאות שונה. מקור השונות בין הגנים יכול להיות ברצף הראשוני, ברמת הביטוי או בשילוב בין השניים. בעבודה זו בחנו בעיקר את השונות ברצף הראשוני ונבנתה תשתית מתאימה לבחינה האם השונות ברצף משפיעה על הנדיפים הנוצרים. 2.8 מטרות המחקר: 1. לבדוק האם יש שוני ברצף הגנטי של AAT מציפה ומקליפה של תפוחי גרני סמיט ופוג'י, ע"י השוואת הרצף הראשוני של חומצות האמינו. 2. לבדוק האם יש יותר מגן אחד של AAT בתפוח מהזנים הנ"ל. 3. לבודד גן המקודד ל AAT מתפוח ולבדוק האם הוא מסוגל לגרום לייצור אצטטים במערכות ביטוי הטרוגניות כדוגמת חיידקים ושמרים. 8

החומר Acetyl CoA Agar Agarose Ampicillin Ammonium Sulfate Bacto yeast extract Bacto tryptone Benzyl alcohol Bis -Tris BMGY BMMY Bradford reagent Butanol 14 C- Acetyl-CoA E.coli DH5α Ethanol Ethylene diamine tetra acetic acid. (EDTA) Etidium bromide (EtBr) Glycerol Hexane InsT/Aclone TM PCR Product Iso propyl β D thio galcto pyranoside (IPTG) Luria Bertani medium (LB) Lysozyme MBI fermentas instaclone PCR cloning kit Methanol 2-Methyl-1 butanol MGY 3. חומרים ושיטות רשימת חומרים ומקורם 3.1 החברה כתובת Sigma Germany Sigma Israel Sigma Israel Sigma Israel Sigma Israel Sigma Israel Sigma Israel Sigma Germany Sigma Israel Invitrogen USA Invitrogen USA Bio-Red Bio-Red Aldrich USA Amersham UK Biosciences Bio-Lab Israel Bio-Lab Israel Sigma Israel Sigma Israel Sigma Israel Bio-Lab Israel Fermentas USA MBI Fermentas USA Sigma Israel Sigma Israel MBI Fermentas USA Bio-Lab Israel Aldrich USA Invitrogen USA 9

Millipore vswp membrane Minipreps DNA Purification Kit Octanol Pentanol Phenethyl alcohol Pichia Expression KiT Plant RNA Mini Kit PPIC9K Vector PTZ57R Vector Propanol Restriction enzyme AVRII Restriction enzyme SNABI Restriction enzyme SNABI Reverse-iT1st strand Synthesis Kit Methyl- tert- butyl ether (MTBE) T4 DNA Ligase X-gal כתובת החומר החברה Millipore )תמר( Promega Aldrich Sigma Aldrich Invitrogen Invisorb Invitrogen MBI Fermentas Sigma-Aldrich MBI Fermentas MBI Fermentas MBI Fermentas ABgene )תמר( Biolab Fermentas INALCO )אורנת( Millipore Corporate Headquarters: 290 Concord Road, Billerica, MA 01821, USA USA USA USA USA USA Germany USA USA USA USA USA USA ABgene House, Blenheim Road, Epsom, Surrey, KT19 9AP, UK Israel USA INALCO S.p.A. /LABO DEPT. Via Calabiana 18 20139 Milano SOC medium ph 7.0 2% Bacto Tryptone 0.5 % bacto yeast extract 8.56 Mm NaCl 2.5 mm KCl 10 mm MgCl 2 20mM Glucose Tris-acetate-EDTA buffer (1x TAE) 40 mm Tris base 20 mm Glacial acetic acid 1 mm M EDTA ph 8 0

3.1.2 טבלה 1: רשימת פריימרים שהשתמשנו בהם בעבודה זו Tm שם הפריימר הרצף מספר בסיסים (ºC) 64.0 20 5'-GCCCTTGGATCATCAAACAC-3' 2727F 72.7 20 5'-AGACGCAAGGGGCAACCGAG-3' 2727R 55.7 20 5'-CTGGTTCTTAAGCTCGTTAC-3' 407F 52.5 20 5'-ATCAGAGCCTGAAATAATAG-3' 407R 59.6 20 5'-TGAGAGTCCTTCGAAAACAG-3' 8896F 61.2 20 5'-GCTTTTCATGTCTTCCCTTG-3' 8896F2 60.7 20 5'-GTATCCCAAGGGAAGACATG-3' 8896R 61.2 20 5'-CAAGGGAAGACATGAAAAGC-3' 8896R2 61.3 23 5'-GCATACCGAAAAATAAAAGTTCC-3' AAT2F 63.2 23 5'-CATTCAAACCTTTGGATAACAGC-3' AAT2R2 59.4 20 5'-CATTGCCATAGTATCCCAAG-3' AATDEL.R2 72.8 30 5'-CAATGGATCCCACTTACATCATTGACATGA-3' BAMHIAAT2R 75.2 33 5'-CTGGCATGCATGCATACCGAAAAATAAAAGTTC-3' SPHIAAT 2 F 3 69.4 23 5'-CAATGTGTGATGCACCTGGATTG-3' AATF4 74.4 31 5'-CGGTACGTAATGATGCCACTAGCAGTCCTTC-3' SNABIAATF 76.9 32 5'-CTTGCGGCCGCCATTACGTTTAACACTTACAT-3' NOTIAATR2 64.7 21 5'-GCCCAACTTGAACTGAGGAAC-3' SEQPIC9R 3.2 חומר צמחי החומר הצמחי בעבודה זו הינו תפוחים מהזנים גרני סמיט ו-פו'גי. עצי התפוח גודלו בחוות מתתיהו )מו"פ צפון(, בגליל העליון בגובה 700 מ' מעל פני הים. עצי התפוח מהזן גרני סמיט ניטעו בשנת 1988 על כנת חשבי. העצים מהזן פוג'י ניטעו בשנת 1994 על כנת.M.M.106 התפוחים נקטפו בסוף עונת הגידול, )31.10.04( כמדד לבשלות היה צבע הגרעין. דיגום 3.2.1 מכל זן נבחרו באופן אקראי שלושה עצים ומכל עץ נקטפו באופן אקראי חמישה תפוחים. מכל תפוח נדגמה רקמת קליפה ורקמת ציפה. הרקמה הושמה מיד בחנקן נוזלי ונשמרה ב -70ºc- להמשך אנליזות. 1

3.3 הפקת RNA מרקמות התפוח שנדגמו רקמת התפוח שנאספה נוקטה ונשטפה במים מזוקקים, לאחר מכן הוקפאה בחנקן נוזלי.הפקת כלל ה RNA- מרקמות התפוח נעשתה מ- 430 מיליגרם רקמה לאחר שנכתשה במכתש ועלי באמצעות הקיט Invisorb Spin Plant RNA Mini Kit של חברת,Invisorb עפ"י הוראות היצרן. סינתזת cdna, Reverse-iT1st strand Synthesis באמצעות קיט RT-PCR בשיטת.Total RNA נוצר מ cdna 3.4 Kit עפ"י הוראות היצרן. 3.5 בידוד גנים ל AAT מתפוח על מנת לבודד את הגן AAT המשוער מהתפוח תוכננו פריימרים ספציפים לרצף mrna של AAT ידוע מתפוח -AY517491(.)GenBank הפריימרים נבחרו מאזור הקודם לקודון ה ATG בקצה 5' פריים ומאזור לאחר ה Stop קודון בקצה ה 3' פריים )איור 2(. ראקצית PCR בוצעה על cdna מהתפוחים גרני סמיט ופוג'י, מרקמת הקליפה והציפה, עם הפריימרים AAT2F ו AAT2R2 )טבלה 1(, בנפח ריאקציה של 25 מיקרוליטר. ראקצית ה PCR התבצעה במכשיר (MJ Research, Watertown, Mass) PCR-150 Minicycler והיא כללה את השלבים הבאים: 1. 94ºC ל- 5 דקות, 94ºC ל- 30 שנית, 55ºC ל- 30 שניות, 72ºC ל- 1.5 דקות, 39 חזרות על שלבים 72ºC, 2-4 ל- 7 דקות, 4ºC ל- 30 דקות. ריאקצית ה PCR- התבצעה במכשיר( Mass PCR-150 Minicycler (MJ Research, Watertown, תוצרי ריאקצית ה- PCR הוטענו על ג'ל אגרוז. הפרגמנטים שהתקבלו בודדו ושובטו כמתואר בסעיף 3.9. ATGATG AAT Stop codon AAT2F AAT2R2 איור : 2 מיקום הפריימרים AAT2F ו AAT2R יחסית לגן AAT ידוע מתפוח. 3.6 ניתוח הרצפים שיטות ביואינפורמטיות רצפי הגנים תורגמו לרצף חומצות אמינו בעזרת תוכנת המחשב ExPASy Translate tool )http://www.expasy.ch/tools/dna.html( רצפי החלבון, רצפי הגנים וה EST's- נבדקו והושוו בעזרת תוכנת Multalin interface page.)http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html) 2

ו, 3.7 בידוד גנים בעלי דמיון ל AAT מתפוח על בסיס סריקת ספרית EST ספרית )http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi( cdna מתפוח נסרקה באמצעות Blast למציאת EST's בעלי דמיון לגן (accession no CAC09064 ( AAT נבחרו שלושה EST's להמשך המחקר: EST מקליפת תפוח מהזן פוג'י, accession numbers AT000407 גודל צפוי EST 440. bp מהזן Royal Gala )רויאל גאלה ( מרקמת הפרי accession numbers CN882727 גודל צפוי bp EST.600 מהזן ( GoldRush ראש מוזהב ) מרקמת הפרח accession numbers CN578896 גודל צפוי 200. bp תוכננו פריימרים ספציפיים עפ"י רצף הEST's ובוצע PCR על cdna מהתפוחים גרני סמיט ופוג'י, מרקמת קליפה וציפה. a.no AT000407 EST הוגבר ע"י הפריימרים 407F ו 407R. a.no CN882727 EST הוגבר ע"י הפריימרים 2727F ו a.no CN578896 EST.2727R הוגבר ע"י הפריימרים 8896F ו ( 8896R טבלה 1(. התוכנית הכללית של ה- PCR כללה את השלבים כמפורט בסעיף 3.5. 3.8 הפרדת DNA על גבי ג'ל אגרוז אלקטרופורזה של תוצרי PCR נעשתה בג'ל אגרוז שהכיל bromide) EtBr (Ethidium,10 mg/ml ריכוז בג'ל. ug/ml 0.4 ההרצה בוצעה בבופר TAE X 1 במתח של.70-90V צילום הג'לים בוצע במצלמת.DNR Bio-Imaging Systems Lt.U.V על מנת לקבוע את ריצפם, הפרגמנטים הנבחרים שובטו לפלסמיד (MBI fermentas instaclone PCR cloning kit) PTZ57R ריצוף הפרגמנטים נעשה ע"י חברת דניאל ביוטק ( פארק המדע, רחובות, ישראל.( ריבוי הגנים 3.9 שיבוט הגנים AAT לפלסמיד ביטוי 3.9.1 תוצר ה AAT, PCR משוער מתפוח מהזנים פוג'י וגרני סמיט מרקמת הציפה הושג בעזרת הפרימרים: BamhIAAT2R )טבלה 1 (.תוצר ה AAT,PCR משוער מקליפת תפוח מהזנים פוג'י SphIAAT 2 F 3 וגרני סמיט הושג בעזרת הפרימרים: AAT2R2,AAT2F )טבלה 1(. תוצרי PCR של ה cdna הורצו ע"ג ג'לים של אגרוז בודדו מהג'ל ושובטו לתוך פלסמיד PTZ57R באמצעות קיט (Fermentas) InsT/Aclone TM PCR Product עפ"י הוראות היצרן. הליגציה התבצעה ע"י האנזים (Fermentas) T4 DNA Ligase בנפח סופי של 30 מיקרוליטר, ב 22 C ל 18 שעות. 3.9.2 טרנספורמציה לחיידקים תוצרי הליגציה הונחו על ממברנה 13mm( (Millipore VSWP 0.025 למטרת דיאליזה למשך שעה. 50 מיקרוליטר חיידקים קומפטנטים ( DH5α )E.coli קפואים ב 70 - C הופשרו על גבי קרח למשך 20 ד'. כ 5 מיקרוליטר מפלסמיד הביטוי הנושא את הגן AAT המשוער הוכנסו אל מבחנת החיידקים 3

הקומפטנטים והושהו ל 2 דקות על גבי קרח. הטרנספורמציה נעשתה ע"י מכשיר האלקטרופורציה Prima) ) EQUIBIO, Easyject ב 1800V עפ"י הוראות היצרן. לאחר הטרנספורמציה הוספו 950 מיקרוליטר של בופר SOC בטמפ' של 37 C אל החיידקים הטרנספורמנטים. החיידקים הטרנספורמנטים נזרעו על צלחות אגר LB שהכילו IPTG, X-gal ואמפיצילין) µg/ml 100(. החיידקים הטרנספורמנטים הודגרו 18 שעות ב 37 C. בחלק מהניסויים בוצעה טרנספורמציה בשיטת ה-.DH5a BIOLAB עם קומפטנטים heat shock השיבוט של תוצר ה- PCR התבצע באתר השיבוט הממוקם בתוך פרגמנט של הגןZ Lac ובכך גורם השיבוט להפרעה בפעילות האנזים. -galactosidase הפרעה זו התבטאה בהופעת מושבות לבנות על גבי צלחות הגידול המכילות את המשרן IPTG והסובסטראט.X-gal המושבות הלבנות חשודות כמושבות הטרנספורמנטיות. 3.9.3 ריבוי והפקת פלסמיד )miniprep( נבחרו מושבות חיידקים לבנות מצלחות הגידול לאנליזה של נוכחות הגן ולהפקה כמותית של הפלסמיד המכיל את הגן המשוער.AAT ההפקה נעשתה ע"י Minipreps DNA Purification Kit של חברת,Promega עפ"י הוראות היצרן. 3.10 3.10.1 פעילות אנזימתית ביטוי הגנים בחיידקים מושבה של חיידקים טרנסגנים שנבדקה ע"י ריצוף לנוכחות ואורינטציה של הגןונמצאה חיובית, גודלה למשך הלילה ב 3 מ"ל מדיום LB נוזלי שהכיל 100 ug/ml אמפיצילין. 500 ul מהתרחיף הועברו ל 50 מ"ל מדיום זהה בבקבוקי אלנמייר בנפח 250 מ"ל והושמו ב 37 C ובטלטול של 200. rpm צפיפות התאים נבדקה במכשיר הספקטרופוטומטר באורך גל 600 nm ובצפיפות O.D=0.4 הוסף למדיום IPTG בריכוז סופי של 0.3Mm והתאים גודלו באותם התנאים למשך 18 שעות נוספות. התאים סורכזו במשך 30 ד' בטמפ' 4 C וב- rpm 13,500. התאים ששוקעו נשמרו בהקפאה להמשך בדיקות אנזימתיות.)Shalit et al. 2003( 3.10.2 ליזאט מתאי החיידקים משקע התאים)סעיף ) 3.10.1 הורחף בבופר ליזיס ph=6.9 bis tris 50 mm והוסף לו ליזוזים ביחס 1:10 בריכוז )60,000 units mg -1 protein( 10 μg/ml התרחיף עורבב והודגר 20 ד' בקרח. לאחר מכן התבצעו שני מחזורים של הקפאה בחנקן נוזלי והפשרה ובסופם סירכוז של 10 ד' ב 4 C וב-.13,500rpm הנוזל העליון ובו החלבון הועבר למבחנה נקייה ונשמר בהקפאה להמשך בדיקות אנזימתיות 2003( al..)shalit et 4

3.10.3 ריאקציה אינזימתית עם סובסטראט מסומן רדיואקטיבית בדיקת פעילות האנזים עם 10mM מיצוי אנזימתי, 30 l וכללה: 100 l נעשתה בנפח של AATFUGF1 סובסטרט אלכוהולי, 2µM סובסטרט רדיואקטיביAcetyl-CoA,(51mCi/mmol) 14 -C הנפח הושלם 30 0 C מבחנות הראקציה הונחו באמבט מים בטמפ' של-.Buffer bis-tris ph 6.9 50mM לאינקובציה למשך שעתיים. בתום האינקובציה המבחנות קוררו בקרח במשך 15 ד' ולכל מבחנה הוסף 1 מ"ל הקסאן. המבחנות עורבבו בוורטקס וסורכזו במשך דקה במהירות של 13,500rpm. הפאזה העליונה, פאזת ההקסאן המכילה את האצטטים שנוצרו ומסומנים רדיואקטיבית),)800ul הועברה למבחנת סנטילציה בנפח 5 מ"ל שהכילה 3 מ"ל נוזל סנטילציה Science( )Gold, Packard Bio. הרדיואקטיביות נמדדה במונה סנטילציה מסוג Tricarb Liquid scintillation analyzer דגם.(Perkin Elmer Inc., USA),2800TR הפעילות האנזימתית ביחידות של fkat חושבה בהתבסס על הפעילות הספציפית של הסובסטרט הרדיואקטיבי, עם התייחסות ליעילות קריאת המכשיר Shalit et al. ( )2003 3.11 3.11.1 אנליזת נדיפים ריאקציה אנזימתית קרה Hexanol 100uM מ"ל ביחד עם 20 Headspace מהליזאט הוכנס לבקבוק 200ul או 100uM,2-methyl-1butanol אצטיל קו- A, בנפח סופי של 400ul שהושלם בבופר bis-tris 50.mM ph 6.9 הריאקציה שהתה באינקובציה ב- 37ºC במשך 3 שעות ולאחר מכן נבדקו תוצרי הריאקציה הנדיפים במכשיר (Agilent Technologies CA, USA) GC-MS בשיטת,SPME 65µm PDMS/DVB( SPME בעת הבדיקה, הוכנסה מחט ה- (Solid Phase Micro Extraction) )polymethylsiloxane/divinylbenzene, Supelco לכל דוגמא למשך 40 דקות. מזרק ה- SPME הוכנס ליחידת ההזרקה של מכשיר ה- GC-MS למשך 5 דקות לאנליזת נדיפים.)Holland et al.,2005( 3.11.2 בדיקת אסטרים במדיום החיידקים 30 מ"ל ממדיום החיידקים הועבר לארלנמייר המכיל 50 מ"ל ether) MTBE (tert methyl butyl לשם מיצוי האצטטים מהשמרים. הדוגמאות טולטלו במשל שלוש שעות במהירות שלrpm 200 בטמפרטורת החדר. הדוגמאות סורכזו במהירות 2000rpm בטמפרטורת החדר. הסולבנט הועבר דרך קולונה שהכילה סודיום סולפט )לספיחת שאריות מים( למכשיר GC-MS לאנליזת נדיפים. ורוכז לנפח של 0.5 מ"ל. 1ul מהנוזל הוזרק 5

3.11.3 זיהוי נדיפים ב- GC-MS אנליזת נדיפים נעשתה במכשיר (Agilent Technologies CA, USA) GC-MS המצויד בעמודה קפילארית בגודל 30 m X 0.25 mm מסוג Rtx-5SIL MS תוצרת חברת.RESTEK כגז נשא שימש הליום )0.8 מ"ל לדקה (. טמפ' ההזרקה כוונה ל- 250ºC בהזרקת.Splitless התנור כוון ל- 50ºC למשך 1 דקה והטמפרטורה הועלתה ל- 200ºC בקצב של 4ºC בדקה. טמפ' הגלאי הייתה.280ºC המסות נרשמו בטווח של 350 45, m/z עם אנרגיית אלקטרונים של 70. ev זיהוי הנדיפים העיקריים נעשה ע"י השוואת ספקטרום מסות וזמן יציאה מהקולונה ( time )retention לאלו של דוגמאות ידועות, ודוגמאות מספריית wiley7n ו HPCH2205 של מכשיר.)Holland et al.,2005(,gc-ms 3.12 ביטוי הגן AATFUGS1 בשמרים 3.12.1 שיבוט הגן AATFUGS1 לפלסמיד ביטוי ייחודי לביטוי בשמרים הפלסמיד ppic9k נחתך באנזימי הרסטריקציה (Fermentas) NotI ו SnabI במשך 18 שעות ב.37ºc לאחר החיתוך, הפלסמיד ppic9k הורץ בג'ל, בודד ונוקה מהג'ל ע"י גרגירי זכוכית. תוצרי PCR של הגן AATFUGS1 שהושגו בעזרת הפריימרים NotI AATR2 ו SnabIAATF )טבלה 1( נחתכו באנזימי הרסטריקציה (Fermentas) NotI ו SnabI במשך שעתיים ב 37ºc ושובטו לתוך פלסמיד ppic9k תחת הפרומוטור של AOX1 איור )2.1(. הליגציה התבצעה ע"י האנזים T4 DNA Ligase עם בופר (Fermentas) מתאים בנפח סופי של 30 מיקרוליטר. SnabiIAATF ATG TGA NotIAATR2 איור : 2.1 מפת הפלסמיד,pPIC9k המחדר מסומן בקו מקוטע. 6

3.12.2 הפלסמיד ppic9k טרנספורמציה לחיידקים למטרות זיהוי וריבוי המשובט עם הגן AATFUGS1 נחתך באנזים רסטריקציה AvriI )עלה חשש שהפלסמיד ייסגר על עצמו לפני הטרנספורמציה( הטרנספורמציה נעשתה לחיידקיDH5α,E.coli בשיטת Shock" "Heat של חברת ביו- לב, עפ"י הוראות היצרן. לאחר ריבוי הפלסמיד בחיידקים והפקתו בשיטת miniprep כמתואר בסעיף 3.9.3 הפלסמיד נשלח לריצוף לוודא את קיומו, כיוונו, ומסגרת הקריאה של הגן בתוך הפלסמיד. 3.12.3 טרנספורמציה לשמר הפלסמיד ppic9k המשובט עם הגן AATFUGS1 מרקמת הקליפה של הזן פוג'י הוכנס אל תאי ביטוי קומפטנטים.)Invitrogen( Pichia pastoris הטרנספורמציה נעשתה במכשיר GENE PULSER II של חברת,BIO-RAD הפרמטרים של המכשיר כוונו ל. Pichia Expression Kit, עפ"י הפרוטוקול המומלץ ב 150 uf, 450vollt, 200 amper לאחר הטרנספורמציה נזרעו השמרים והודגרו ב 30C ל 36 שעות על צלחות MGY.MGY הינו מצע גידול מנימלי, למטרות סלקציה לשמרים טרנסגנים, לשמרים הטרנסגנים ביטוי גדול יותר של אלכוהול אוקסידז המאפשר ניצול מתנול כמקור יחיד לפחמן. ממושבות השמרים שצמחו, נבחרה מושבה לבדיקת נוכחות הגן AATFUGS1 ע"י PCR בעזרת הפריימרים SeqPic9R ו AATF4 )טבלה 1). 3.12.4 הפקת החלבון הרקוממביננטי מהשמרים עפ"י הפרוטוקול המומלץ ב, Pichia Expression Kit מושבה בודדת שנבדקה בPCR לנוכחות הגן הוכנסה ל 25 מ"ל מדיום גידול BMGY למשך 18 שעות בטמפ' 30 C ובטלטול של 250. rpm בצפיפות של 2-3= 600 OD הושקעו התאים ע"י סירכוז של 5 ד' ב 3000 g בטמפ' החדר. משקע התאים הורחף ב 100 מ"ל מדיום BMMY להמשך גידול ב- 30 C ובטלטול של 250. rpm כל 24 ש' הוסף למדיום הגידול מתנול בריכוז סופי של 0.5%. כעבור 48 ש' התאים שוקעו ע"י סירכוז של 20 ד', ב- 500 rpm וב 4 C, הפאזה הנוזלית המכילה את החלבון הרקומביננטי הוקפאה ב- 80 C - להמשך בדיקות אנזימתיות. 3.12.5 ריכוז וניקוי החלבון ל 20 מ"ל מיצוי חלבון הוסף,לאט ובכמויות קטנות, 7 ג"ר של אמוניום סולפט התהליך נעשה על גבי קרח. לאחר מכן המבחנות שהו שעתיים ב C 4, סורכזו במשך 6 ד' במהירות 12,000 rpm בצנטרפוגה מקוררת ל 4C. הפאזה העליונה שאינה מכילה חלבון הושלכה, פלט החלבון הורחף ב 3 מ"ל בופר Bis tris והוטען על קולונת 15( X 120 mm, Bio-Rad) P6 הנוזל נאסף בפראקציות של 1.5 מ"ל. הפראקציות נבדקו ע"י ריאגנט ברדפורד לקביעת הפראקציה בה ריכוז החלבון הגבוה. הפראקציה בעלת ריכוז החלבון הגבוה נבחרה לבדיקת פעילות. 7

3.12.6 ריאקציה אינזימתית עם סובסטראט מסומן רדיואקטיבית בדיקת פעילות האנזים AATFUGS1 נעשתה בנפח כולל של 100μl וכללה: 30μl מיצוי חלבון, 10μl סובסטרט רדיואקטיבי,(51mCi/mmol) 14 C- Acetyl-CoA2µM סובסטראט אלכוהולי.10mM או 100mM \ *תערובת אלכוהולים( בריכוז סופי של 2methyl Butanol ) נפח הראקציה הושלם עם בופר.Bis tris 50mM ph 6.9 אינקובציה למשך שעתיים ב 30 C, קירור המבחנות על גבי קרח למשך בוורטקס, סירכוז במהירות. 12,000 rpm האצטטים אל מבחנת סנטילציה המכילה 15 ד' וסירכוז קל, הוספת 1 מ"ל הקסאן ועירבוב של 15 ש נ' העברת 850μl מהפאזה העליונה, פאזת ההקסאן המכילה את 3 מ"ל נוזל סנטילציה Ultima Gold, Packard Bio) Tricarb Liquid scintillation analyzer הרדיואקטיביות נמדדה במונה סנטילציה מסוג.)Science דגם USA).(Perkin Elmer Inc., הפעילות האנזימתית ביחידות של picokat חושבה,2800TR בהתבסס על הפעילות הספציפית של הסובסטרט הרדיואקטיבי, עם התייחסות ליעילות קריאת המכשיר. * תערובת האלכוהולים מכילה.Phenetheyl alcohol, propanol, butanol, pentanol,octanol הריכוז של כל אלכוהול הואmM 2.5 או. 20 mm 3.12.7 אנליזת נדיפים ב - GC-MS ראקציה אינזימתית קרה כ 10 מ"ל של תרבית שמרים טרנסגנים בת 24 ש' הוכנסה לבקבוק 20 Headspace מ"ל ביחד עם הסובסטרטים האלכוהולים 2 methyl Butanol בריכוז סופי של 1 Hexanol 25, μm בריכוז סופי של 25μM ו Benzyl alcoho בריכוז סופי של 25 μm ו Acetyl CoA בריכוז סופי של 2. μm הראקציה שהתה באינקובציה של 24 ש' ב 30 C ובטילטול של 250. rpm הראקציה הועברה לבדיקת תוצרים נדיפים במכשיר ה GC-MS כמתואר בסעיף 3.11.3 8

4.תוצאות 4.1 בידוד גנים בעלי הומולוגיה גבוהה ל AAT מתפוח במטרה לבודד את הגן השלם מרקמות התפוח הנבדקות, נקטפו תפוחים בשלים מהזנים פוג'י וגרני סמיט. מכל זן הופרדו רקמות הציפה והקליפה והופק מהןRNA. הגברת הגן השלם נעשתה ע"י שימוש בפריימרים ספציפיים המכילים את ח.א. מתיונין בקצה 3 ואת ה Stop codon בקצה 5 ובעזרת טכניקת ה PCR כמתואר בסעיף 3.5. הגנים שבודדו מתפוח, מכילים bp 1380 המקודדים ל 460 חומצות אמינו. הגנים בודדו משני זני התפוח הנבדקים גרני סמיט ופוג'י ומשתי סוגי רקמות, קליפה וציפה )איור 3(. הגן AAT שבודד מתפוח גרני סמיט, מרקמת הציפה כונה.AATGRANF1 הגן AAT שבודד מתפוח גרני סמיט, מרקמת הקליפה כונה.AATGRANS1 הגן AAT שבודד מתפוח פוג'י, מרקמת הקליפה כונה.AATFUGS1 הגן AAT שבודד מתפוח פוג'י, מרקמת הציפה כונה.AATFUGF1 רצף חומצות האמינו של ארבעת הגנים שבודדו מכיל את האזורים השמורים המאפיינים חלבונים ממשפחת ה BAHD )איור 3.1(. איור 3: הגברה של מקטעי cdna של הגן AAT מתפוח, AATGRANF1,AATGRANS1.PCR תוצרי 20μl בכל בארית הוטענו,AATFUGS1, AATFUGF1 9

איור 3.1: השוואת רצף חומצות האמינו המקודדות ע"יAATFUGS1, AATGRANF1,AATGRANS1,AATFUGF1 לרצף חומצות האמינו של AAT ידועים מתפוח,accession no. CAC09064,accession no. AAR99826.1,accession no. AAS79797 חומצות האמינו המודגשות בצהוב הן האזורים השמוריםHXXXD ו FGWG המאפיינים חלבונים ממשפחת הBAHD. השוואת הרצפים נעשתה מהמתיונין הראשון. 0

רצף חומצות האמינו בגנים שבודדו בעבודה זו והשוואתם ל AAT אחרים ידועים מתפוח. AATFUGS1, AATGRANF1, 4.2 השוואת רצף ח.א של החלבון המקודד מהגנים,AATFUGF1 AATGRANS1 לרצף חומצות האמינו של AAT ידועים מתפוח הראתה הבדלים בין זני התפוחים ובין רקמות התפוח )טבלה 2(. הבדלים ייחודיים נמצאו באזור 26 ברצף, בציפת התפוח גרני סמיט מופיעה ח.א גליצין )G( לעומת ח.א. גלוטאמט )E( המופיעה בשאר הרצפים הנבדקים. באזור 39 ברצף הגן שבודד מציפת פוג'י, מופיעה ח.א סרין )S( לעומת ח.א. לאוצין )L( המופיעה בשאר הרצפים הנבדקים. באזור 252 ברצף, בפוג'י קליפה מופיעה ח.א היסטידין )H( לעומת ח.א גלוטמין )Q( ובאזור 280 ברצף, בפוג'י קליפה מופיעה ח.א ליזין )K( לעומת ח.א אספרגין )N( המופיעה בשאר הרצפים הנבדקים. באזור 300 ברצף, בפוג'י קליפה מופיעה ח.א היסטידין )H( לעומת ח.א אספרגין )N( המופיעה בשאר הרצפים הנבדקים ובאזור 317 ברצף, בפוג'י קליפה מופיעה ח.א טראונין )T( לעומת ח.א אלנין )A( המופיעה בשאר הרצפים הנבדקים. AAT CAC09064 AAR99826.1 AAS79797 AATFUGS1 AATGRANS1 AATFUGF1 AATGRANF1 מיקום ברצף S P P P P P P 3 F L F L L L L 4 Q Q Q H H H H 8 P L L P P P P 14 E E E E E E G 26 T T A T T T T 27 S G G F F F F 38 L L L L L S L 39 V F F F F F F 41 I V V I I I I 45 R C C R R R R 59 R K K K R R R 84 V M M M V V V 92 V V V V I I I 103 L L L L V V V 144 L A V A L L L 162 A P P P A A A 170 A A S A A T A 202 A A A V A A A 211 G G D D G G G 220 Q Q Q H Q Q Q 252 L L L V L L L 257 N N N K N N N 280 N N N H N N N 300 A A A T A A A 317 I V I V I I I 319 V A A A V V V 397 T S T T T A T 413 טבלה 2: ההבדלים בחומצות האמינו עפ"י השוואת הרצפים באיור 3.1. הבדלים ייחודיים לרצף אחד מסומנים בצהוב. 1

4.3 השוואת רצף חומצות האמינו של AAT שבודד מהזן פוג'י מרקמת קליפה העשירה באצטטים ל AAT שבודד מהזן גרני סמיט מרקמת ציפה ללא אצטטים. בקליפת התפוח של הזן פוג'י, נוצרים מספר סוגים של אצטטים ובכמות גדולה לעומת ציפה של תפוח מהזן גרני סמיט שלא נוצרים בה אצטטים ( 2005 al.,.)holland et בהשוואת רצף חומצות האמינו של AAT שבודד מרקמת קליפה של תפוח פוג'י )AATFUGS1( לרצף חומצות אמינו שבודד מציפת תפוח גרני סמיט,)AATGRNF1( נמצא הבדל של 14 חומצות אמינו )איור ) 3.2 חומצות האמינו אינן נמצאות באתר הפעיל או באזורים הידועים כאזורים שמורים. איור 3.2: השוואת רצף חומצות האמינו המקודדות ע"יAATGRANF1 ל.AATFUGS1 האזורים השמורים HXXXD ו FGWG המאפיינים חלבונים ממשפחת ה BAHD מסומנים בירוק. השוואת הרצפים נעשתה מהמתיונין הראשון. 2

4.4 שונות ברצף חומצות האמינו בגנים שבודדו בהשוואה לAAT פעילים מאורגניזמים שונים. השוואת רצף ח.א של החלבון AATFUGS1, AATGRANF1, AATGRANS1,AATFUGF1 לרצף חומצות האמינו של AAT פעילים מתפוח, בננה, ורד, תות, מלון ואגס הראתה הבדליםמשמעותיים ברצף באורגניזמים השונים, אולם, האזורים השמורים קיימים בכל הרצפים )איור (. 4 איור 4: השוואת רצף חומצות האמינו המקודדות ע"יAATFUGS1, AATGRANF1,AATGRANS1,AATFUGF1 לרצף חומצות האמינו של AAT פעילים מאורגניזמים שונים. האזורים השמורים HXXXD ו FGWG המאפיינים חלבונים ממשפחת ה BAHD מסומנים בירוק. השוואת הרצפים נעשתה מהמתיונין הראשון. 3

4.5 שימוש במסד נתונים של EST's מתפוח להגברת גנים בעלי דמיון ל AAT מתפוח ובדיקת ביטויים ברקמות התפוח. על מנת לנצל את הידע הקיים עד כה בתפוח עשינו השוואה של גן ידוע מתפוח ( CAC09064 (accession no. באמצעות תוכנת ההומולוגיה.Blast ההשוואה הראתה דמיון ברמה משתנה ל EST's 14 מתפוח )איור 5(. נבחרו שלושה EST's להמשך המחקר. הגברת הגן נעשתה ע"י שימוש בתחלים ספציפיים ובעזרת טכניקת ה PCR כמתואר בפרק חומרים ושיטות. בבחינת התוצאות נראה כי גן דמוי accession no. AT000407 EST מתבטא בשני זני התפוח גרני סמיט ופוג'י ובשני סוגי הרקמות קליפה וציפה )איור 6(. גן דמוי accession no. CN882727 EST מתבטא בתפוח מזן גרני סמיט בעיקר בקליפה ומעט מאד בציפה )איור 6.1(. גן דמוי accession no. CN578896 EST נמצא בקליפת תפוח מזן גרני סמיט ובציפת תפוח מזן פוג'י אולם גודל המקטע שהתקבל היה קטן מהצפוי 200bp )איור 6.2(. איור : 5 תוצאות השוואת גן לAAT ידוע מתפוח ( CAC09064 (accession no. באמצעות תוכנת ההומולוגיה.Blast איור 6: הגברת מקטעי cdna על בסיס הרצף הידוע של הEST's (accession no AT000407( מה )Sung et al. 1998( EST database בכל בארית הוטענו 20μl תוצרי.PCR 4

איור 6.1: הגברת מקטעי cdna על בסיס הרצף הידוע של הEST's (accession no. CN882727( בכל בארית הוטענו 20μl תוצרי.PCR איור :6.2 הגברת מקטעי cdna של ה (accession no. CN578896( EST's בכל בארית הוטענוμl.cDNA 20 בהשוואת הרצפים של ה EST's הנ"ל לגן,)accession no CAC09064) AAT נימצא כי EST's a.no CN578896 EST נמצאים באזור '5 פריים של הגן ו a.no ו CN882727 a.no AT000407 מכסה את אזור אמצע הגן עד 3 פריים של הגן )איור 7(. ל CN882727,a.no AT000407 EST's 5

a.no ו CN578896 a.no שונות גבוהה יותר ברצף בהשוואה לארבעת הרצפים שבודדו ותוארובסעיף 4.1. מידת הזהות בין הרצפים הללו לרצף המקודד ל- AAT היא: 89%, 73% ו 89% בהתאמה. בהשוואת רצף חומצות האמינו של a.no AT000407 EST לא נמצאו הבדלים משמעותיים יחסית לרצף חומצות האמינו המקודד מגנים של AAT ידועים מתפוח )התוצאות לא מוצגות(. בהשוואת רצף חומצות האמינו של EST EST ידועים מתפוח נמצא כי ב AAT לרצף חומצות האמינו של a.no CN882727 a.no CN882727 מופיעה חומצת האמינו M פעם אחת בעוד שברצפי AAT ידועים מתפוח מופיעות שתי חומצות האמינו M בקצה 5' פריים של החלבון. בנוסף קיימים הבדלים ברצף חומצות האמינו הייחודיים ל EST a.no CN882727 ושאינם מופיעים ברצפי חומצות האמינו של AAT ידועים מתפוח )איור.) 8 בהשוואת רצף חומצות האמינו של EST ידוע מתפוח נמצא כי ל EST AAT לרצף חומצות האמינו של חלבון a.no CN578896 a.no CN578896 יש חסר של 12 ח.א יחסית לגן השלם )איור 7,(. )accession no CAC09064) הגן AAT EST CN882727 נמצא בגרני ציפה וגרני קליפה מיקום החסר של 12 ח.א. בEST לעומת הגן השלם EST CN578896 נמצא בגרני קליפה ופוג'י ציפה EST AT000407 נמצא בגרני ופוגי בקליפה ובציפה איור : 7 תצוגת מיקום ה EST's יחסית לגן השלם. האזור המסומן באדום הוא אותו אזור בגן השלם בו קיימות 12 חומצות אמינו שאינן קיימות ברצף של הגן דמוי. accession no. CN578896 EST 6

איור 8: השוואת רצף חומצות האמינו המקודדות ע"י גן לAAT מתפוח AY707098( (accession no. וגנים המקודדים ל AAT שבודדו בעבודה זו לרצף חומצות האמינו שלEST.accession no CN882727 האזור המסומן בצהוב מסמן שינויים ייחודייםEST.CN882727 בבדיקת רצף חומצות האמינו של a.no CN578896 EST נמצא כי שתיים עשרה חומצות האמינו החסרות הן:,glycine,arginine שתי ח.א,alanine,asparagine שלוש ח.א., valine שתי ח.א.,isoleucine lysine ו histidin )איור.) 9.a.no. CN578896 האזור בו איור : 9 השוואת רצף AAT מתפוח CAC09064) (accession no. לרצף EST חסרות 12 ח.א מסומן בצהוב. 7

4.6 הגברת הגן דמוי a.no CN578896 EST המכיל את האזור בו חסרות 12 ח.א '3 על מנת לבדוק האם מתבטא בתפוח גן שיש לו חסר של 12 ח.א בהתאם ל a.no CN578896 EST ולרצף את אזור החסר בגן נלקח תחל ספציפי מאזור החסר:.8896R2 5'.8896F 5' CAAGGGAAGACATGAAAAGC TGAGAGTCCTTCGAAAACAG '3 התחלים שישמשו להגברת האזור ללא החסר מהגן AAT השלם. 8896.F 5' TGAGAGTCCTTCGAAAACAG '3.AATDEL.R2-5' CATTGCCATAGTATCCCAAG '3 התוצר הצפוי של הגן הנושא בחוסר יהיה קטן ב 50bp לעומת הגן ללא החסר )איור 11(. 8896F AATDELR2 8896R2 8896R2 איור 10: השוואת רצף הנוקלאוטידים של הגןAAT מתפוח CAC09064) (accession no. לגן דמוי, accession no CN578896 EST בו חסרים 36bp התחל הספציפי לאזור החסר מסומן באדום שאר התחלים מסומנים בכחול. במטרה לבדוק את ביטוי הגן דמוי EST החסר, a.no CN578896 המכיל חסר של 12 ח.א. לעומת הגן ללא נעשתה הגברה של מקטע הגן AAT מתפוח המקביל ל EST המכיל את אזור החסר. נעשה שימוש בתחלים ספציפים מאזור החסר כנ"ל ובטכניקת PCR כמתואר בחומרים ושיטות. החוסר של 50bp בא לידי ביטוי בגודל מולקולת ה DNA ובאופן תנועתה בג'ל אגרוז. ניתן לראות כי מקטע הגן AATללא החסר של 12 ח.א. מתבטא בכל רקמות התפוח, ביטויו חזק וגודלו 200bp. לעומתו, הגן דמוי EST 8

CN578896 המכיל חוסר של 12 ח.א. המתבטא בקליפת תפוח מזן גרני סמיט ובציפת תפוח מזן פוג'י, ביטויו חלש וגדלו קטן מ 200bp )איור 11(. איור 11: תוצאות הגברת מקטע הגן (accession no. CAC09064) AAT ותוצאות תוצרי הגברת הגן דמוי.a.no. CN578896 EST הרצת תוצרי הPCR נעשתה על גבי ג'ל אגרוז%. 2.5. בכל בארית הוטענוμl.cDNA 23 לסיכום, נבדק בעבודה זו ביטוי של שלושה גנים דמוי accession no. AT000407 EST :EST's AAT והביטוי של גן ל.accession no. CN578896 EST,accession no. CN882727 EST, בשני זני תפוח, ברקמות הקליפה והציפה. סיכום התוצאות מוצג בטבלה 3. תפוח גרני רקמת קליפה + תפוח גרני רקמת ציפה + תפוח פוג'י רקמת קליפה + תפוח פוג'י רקמת ציפה + /EST גן AAT + - - + EST a.no CN578896 - - + + EST a.no CN882727 + + + + EST a.no AT000407 טבלה 3: נוכחות הרצפים שנבדקו בזני וברקמות. התפוח הסימן "+" מעיד כי הגן EST/ מתבטא ברקמה. הסימן "-" מעיד כי הגן EST/ אינו מתבטא ברקמה. 9