<4D F736F F D20F4F8E5E9F7E820E02D20F9E9E1E5E820E2EF20ECFAE5EA20E5F7E8E5F82E646F6378>

תמליל

1 פרויקט א' שיבוט גן לתוך וקטור במהלך ניסוי זה נשבט גן = מחדר = insert לתוך פלסמיד = וקטור = נשא, בשם. KS שיבוט גנים נועד למטרות שונות : לצורך ריבוי הגן וסימונו רדיואקטיבית או פלורוסנטית כדי שישמש כגלאי. לצורך יצירת חלבונים מסומנים רדיואקטיבית. הפקת הגן בתוך פלסמיד בכמויות גדולות והחדרתו בטרנסקציה כדי לבטא את החלבון בתאים. על מנת לזהות אינטראקציות בין חלבונים. לצורך יצירת נוגדנים. יש חשיבות להקפיד על הימצאותו של. stop codon יש לבדוק שהאנזימים בעזרתם אנחנו חותכים, לא חותכים את הגן עצמו. לרוב משבטים רק את ה- ORF של הגן. תהליך השיבוט מתבצע במס' שלבים חיתוך הפלסמיד KS בעזרת אנזימי רסטריקציה BamHI + PstI וניקוי הפלסמיד לאחר החיתוך. הגברת המחדר אותו אנחנו מעוניינים לשבט לתוך הפלסמיד בשיטת ה- PCR כך שקצוות התוצר המוגבר מכילים את אתרי החיתוך לאנזימים. BglII + PstI ניקוי התוצר המוגבר כפי שנעשה בסעיף א' וזאת על מנת להכינו לתהליך החיתוך. חיתוך הגן המוגבר בעזרת אנזימי הרסטריקציה הנ"ל. ניקוי המחדר החתוך הכנה לליגציה. הפרדת הווקטור והמחדר החתוכים והמנוקים (המוכנים לליגציה) בג'ל אגרוז 0.7% לצורך הערכת כמויות הדנ"א. כמו כן מדידת ריכוז הדנ"א ע"י מדידת הבליעה באורך גל של. 260nm ליגציה בין הווקטור לבין המחדר בעזרת האנזים ליגאז למשך לילה בטמפ' של. 16 C טרנספורמציה של תוצר הליגציה לתוך חיידקי XL Blue וזריעת החיידקים על גבי קרקע מזון מוצקה המכילה : אמפיצילין, gal. IPTG, X המושבות הכחולות הן חסרות המחדר ואילו הלבנות הן בעלות המחדר. בדיקת המושבות הלבנות בשיטות השונות ע"י הפקת פלסמידים חדשים, חיתוכם, שליחתם לריצוף על מנת לוודא שאומנם המחדר נכנס לפלסמיד ובמקום הנכון. בדיקת פעילות הליגאז. הפלסמיד הפלסמיד מכיל : - עמידות לאמפיצילין : הגן bla, אשר מקודד לחלבון β לקטאמז. חלבון זה מפרק את הטבעת הלאקטמית בקבוצת הפניצילין. - Ori : לשם הכפלת הפלסמיד באופן עצמאי ללא קשר לגנום. שהוא חלק מה- Lac גלאקטוזידאז מקודד ל- β : Lac Z - אופרון. :MCS- נמצא בתוך ה- LacZ. המטרה של המיקום שלו הוא כדי שנכניס את המחדר לתוך ה- LacZ, יהיה שעתוק אבל תרגום של β גלאקטוזידאז ייעצר. ה- β גלאקטוזידאז הוא אינדוסיבילי. על הפלסמיד ישנו פרומוטור,שאיננו מצויר, וזהו הפרומוטור של ה- LacZ, והוא עובר אינדוקציה בנוכחות, IPTG שהוא אנלוג ללקטוז. נזכיר כי קישור של לאקטוז מסיר את הרפרסור מהפרומוטור וכך גם. IPTG

2 X-gal גם הוא אנלוג ללקטוז אך במקרה זה הוא ניתן כסובסטרט לאנזים β גלאקטוזידאז. בפירוק ישנו תוצר כחול. ולכן בכנסת המחדר הנחנו "דופקים" את הגן β גלאקטוזידאז ואין מה שיפרק את ה- Xולכן gal המושבות יהיו לבנות (אם המחדר נכנס). ואם המחדר לא נכנס אין מה ש"דופק" את ה- β גלאקטוזידאז והמושבות יהיו כחולות. שלב א' חיתוך הפלסמיד ריכוז 200 ng\µl : KS יש צורך ב : 3µg ולכן לפי ערך משולש יש צורך ב : 13.6µl. בופר : מגיע בריכוז. 10 X יש צורך בנפח סופי של 140 µl ולכן ניקח -.14µl אנזימים : 3µl מכל אחד מהאנזימים. מים : השלמה ל- 140, µl ולכן יש צורך ב µl סרכוז קצר = ספין דאון. הדגרה ב- 37'C, לשעה וחצי. חומרים מים מטוהרים מיונים בופר דנ"א בתום תהליך החיתוך יש להוסיף אלקליין פוספטאז µl. 1 לסרכז שוב ל- 10 שניות והדגרה בטמפ' של C'50 לחצי שעה. כמויות µl 14µl 13.6µl 3µl 3µl BamHI PstI שימוש באנזימי רסטריקציה חייב להתבצע במחשבת תחילה : יש לבדוק את אתרי החיתוך ואת כיוון החיתוך. במידה וחותכים עם 2 אנזימים יש להתאים את הבופר לפעילות האופטימאלית ל- 2 האנזימים. יש לבדוק האם יש לאנזימים יש. star activity לעיתים אנזימים לאו דווקא חותכים באופן ספציפי אלא באופן בלתי ספציפי, וזאת מסיבות שונות : ריכוז מלחים לא נכון, PH לא אופטימאלי, נוכחות חומרים שונים (גליצרול, אתנול..). יש להחליט האם אנחנו מעוניינים להפעיל את האלקליין פוספטאז CIAP, המוריד את הפוספט בקצה ה- '5. יש לבדוק האם אתרי החיתוך מועדים לפעילות של מתילאזות הנמצאות בחיידקי, E.coli כגון. Dam,Dcm ברגע שאתר הרסטריקציה עובר מתילציה בחיידקים, הוא עלול לא לחתוך באתר. פתרון אפשרי : הפקת פלסמיד לא ממותל מהזן של אי.קולי למשל GM48:. מים מטוהרים מיונים מים שעברו מס' קולונות המיועדות להרחיק את כל היונים והחומרים שבמים. אתרי החיתוך של I BamHI + PstI BamHI 5' GGATCC 3' 3' CCTAGG 3' PstI 5' CTGCAG 3' 3' GACGTC 5' לא לשכוח לרשום בכתב יש ולצרף את מה שמלי נתנה לנו.

3 שאלות ע"מ 7 כן לכל האנזימים שהשתמשנו איתם יש. star activity. כן השתמשנו בבופר המתאים. בופר K הוא הבופר האופטימלי. בגלל ה- starשל activity BamHI לא אין בופר אחר שנוכל להשתמש בו. אף אחד ממהאנזימים שלנו לא עובר מתילציה. בע"מ הקודם. קצה '5 overhang נשתמש ב- Klenow fragment שזהו חלק מהרנ"א פולימרז 1 שמשלים. 3' 5' '3 '5. ואילו אם יש לנו '3 overhang נשתמש אקסונוקלאז שמקצץ כדי שלא ייסגר על עצמו, ולא יוכל לסגור את הקשר הפוספו-די- אסטרי. נאמר כבר בפירוט למעלה. נאמר כבר שלב ב' ניקוי הפלסמיד החתוך הפלסמיד החתוך מן המלחים, האנזימים והחתיכות הקטנות של הדנ"א על מנת שפעילות בשלב זה ננקה את הליגאז בהמשך התהליך תתרחש בבופר המספק תנאים אופטימאליים לפעילות האנזים. הניקוי נעשה בעזרת לניקוי מקטעי דנ"א הגדולים מ- 100bp. ערכה מיוחדת מבחנת הפילטר שנשתמש בה כדי לבצע את תהליך מסיליקה.בופר הקישור שאנחנו הניקוי עשויה (הפילטר) גואנידין איזותיוציאנט ו 0.5M מוסיפים מכיל : 4.5M פוטסיום אצטט. הגואנודין הוא מלח כאוטרופי אשר בריכוז גבוה גורם לשינוי מבנה המים מסביב לסילקה מאפשר יצירת גשר קטיוני בין ובנוכחות יוני פוטסיום הסיליקה למטענים השלילים של הדנ"א ולדחיית מולק' נקשר הדנ"א לסיליקה. המים מהסילקה כך לחמם 100µl מים מטוהרים מיונים לטמפ' של. 50 C שווה לנפח הריאקציה ( להכניס למבחנה המכילה את הריאקציה 140µl בופר קישור (נפח לתוך מבחנת הפילטר יש להוסיף את הדנ"א מסעיף 2 ולסרכז 60 שניות. בתום הסרכוז הדנ"א נשאר קשור לסיליקה בעוד שיתר החומרים הורחקו למבחנת איסוף. להוסיף 700µl בופר שטיפה ולסרכז. להוסיף 500µl בופר שטיפה ולסרכז. לסרכז על יבש 30 שניות. שאריות אתנול עלולות לעכב את הריאקציה. להוסיף 50µl מים מטוהרים מיונים מחוממים. הם יגרמו לדנ"א לעבור אילוציה מהסיליקה זאת vector מוכן לליגציה. מבחנה 2 מבחנות : להכין עוד 1.5µl צבע לדנ"א. 3µl :Vector for gel מהווקטור הנקי + 10µl מים מטוהרים מיונים + OD 7µl : Vector for וקטור נקי + 44µl מים מטוהרים מיונים. -XC קסילן ציאנול,ו- 20% גליצרול ברומו פנול בלו, -BPB מכיל 2 חומרים קטנים מולקולרים: Loading dye ולשקוע בבאריות כאשר גורמת לצפיפות הדנ"א להיות גבוהה מזו של בופר ההפרדה שצפיפותו הגבוהה הוא שלילי יותר ולכן רץ יותר מטעינים אותו. החומרים הקטן מולקולרים רצים לפי מטען ולא לפי גודל : BPB יותר למעלה. חומרים אלו אינם נקשרים לדנ"א, אלא משמשים מדד איכן הפלסמיד \אינסרט למטה ו- XC רץ שלילים בכלל קבוצות הסולפאט. נמצאים בג'ל. מהירות הריצה קבוע בהתאם למטען החשמלי שלהם. שניהם ניתן לראות כמה bp שווים באחוזי אגרוז שונים, החומרים האלו ינדדו באופן שונה (עבור כל אחוז אגרוז עוזר לנו לדעת איכן הדוגמא החומרים האלו) וכך ניתן לעקוב אחרי ההרצה (עושה לנו חיים יותר קלים), זה יש לנו מעגל חשמלי סגור. נמצאת בג'ל, האם

4 שאלות ע"מ 9 1. נאמר כבר 2. המלחים מתחרים עם הדנ"א על הקישור במים מה שגורם לדנ"א לשקוע. 3. החלבון H-NS הוא חלבון שקיים בחיידקי גראם שלילים וקושר רצפי דנ"א בספציפיות נמוכה. החלבון הזה מתפקד כרפרסור של שעתוק ולאחר קשירתו לדנ"א הוא גורם לקיפול ולסגירת הדנ"א. בנוסף הוא גורם לסופר קויל ומתפקד כמעין היסטון. 4. בופר השטיפה הכיל הרבה אתנול הממיס חלבונים בעלי קצה הידרופובי. כך שהם נשטפים החוצה מהסיליקה. שלב ג' הגברת המחדר ב- PCR אורך מסגרת הקריאה שנגביר היא 2471bp. יש להוסיף אתרים לאנזימי חיתוך (6 נוקליאוטידים) וקצוות (5 נוקליאוטידים ( בכל פריימר : סה"כ 11 נוקליאוטידים = 2 X 22. אנחנו משתמשים בתערובת PCR שהוכנה מראש : = 2490 bp בופר המתאים לפעילות האנזים, DNA Pol המכיל גם Mg+2. אנזים. Taq DNA Pol תוכנית ה- PCR 4 הנוקליאוטידים הדרושים לסינתזה. פריימר קדמי ופריימר אחורי. פעילות דנטורציה דנטורציה זמן 1 min טמפ' 94 C שלבים Step 1 Step 2 Step 3 94 C 61 C 40 sec 40 sec annealing סינתזה דנטורציה Step 4 Step 5 Step 6 Step 7 72 C 94 C 65 C 3 min משלב 2 3 סיבובים 40 sec 40 sec Annealing סינתזה סינתזה Step 8 Step 9 Step 10 Step C 72 C 3 min משלב 6 30 סיבובים 10 min

5 טמפ' האנילינג היא בד"כ 5 C מתחת ל- Tm של הפריימר בעל ה- Tm הנמוך יותר. טמפ' אנילינג נמוכה מידי תגרום ליצירה של תוצרים לא ספציפיים ולעומת זאת טמפ' גבוהה מידי עלולה לגרום לאי היווצרות התוצר הרצוי. את הפריימרים ל- PCR מתכננים מראש. שיקולים בתכנון הפריימרים ל- PCR התאמה של 18 נוקליאוטידים בין הפריימר לדנ"א המטרה, כדי שההדבקה תהיה טובה. בקצה הפריימרים יש להכניס אתרי רסטריקציה בנמצאים ב- MCS. וזאת משום שאנחנו יודעים שאנזימים אלו חותכים רק פעם אחת בפלסמיד וכך הפלסמיד לא יחתך מס' פעמים. ניתן להשתמש באנזימים שונים לחיתוך הפלסמיד ותוצר ה- PCR בתנאי שיש להם אותו קצה דביק או שהם חותכים ומשאירים קצה חלק. אסור שהאנזימים הנבחרים יחתכו בתוך הגן המוגבר ב-. PCR במידה ואנחנו מכניסים בהמשך לתג מסוים, יש לשמור על מסגרת קריאה נכונה. אם לא תשמר מסגרת הקריאה לא ייווצר החלבון. כאשר התג קצר רצוי להוריד את ה- ATG של הגן על מנת שתחילת התרגום בריבוזום יהיה מה- ATG של התג. יש להקפיד על קודון עצירה בפריימר האחורי בסוף מסגרת הקריאה. יש לבחור פריימרים בעלי Tm דומה. %GC לא גבוה מ % למניעת הדבקה לא ספציפית לתבנית. בספר MCB פרק 4 מתואר ניסוי קביעת. Tm יש לבחור פריימרים בעלי G חיובי או שלילי נמוך וזאת מאחר ו- G שלילי הוא ריאקציה מועדפת ומשמעות הדבר שהפריימרים יסגרו על עצמם במבנה שניוני וכך שלב ההדבקה של הפריימרים לדנ"א המטרה יהיה פחות יעיל. בקצה כל פריימר, במעלה אתר ההגבלה, בקצה ה 5 יש להכניס זנב של כ- 5 נוקליאוטידים וזאת משום בקצה כל פריימר, במעלה אתר ההגבלה, בקצה '5 יש להכניס זנב של כ- 5 נוקליאוטידים וזאת משום שאנזימי ההגבלה יוצרים קומפלקס אנזים סובסטרט באופן יעיל יותר כאשר יש נוקליאוטידים נוספים במעלה האתר. הרבה אנזימים לא יחתכו כלל אם לא יהיה זנב כזה של נוקליאוטידים בקצה. 5' שאלות ע"מ 13? בסייקל הראשון : בסייקל השני : בסייקל השלישי :

6 בסייקל הרביעי : 6. נוכל לראות בג'ל רק מקטע שעבר הגברה אקספוננציאלית. 7. מקטעים לא ספציפיים עלולים להיכנס לפלסמיד. 8. הרצת כל התוצרים בג'ל. רואים איזה תוצר הוא ספציפי ומנקים את התוצר הרצוי מהג'ל (יש ערכה לכך (. 9. להעלות את טמפ' ה-. Tm זאת כדי להימנע מנוכחות תוצרים לא ספציפיים. והעלאת טמפ' האנילינג. 10. זמן ממושך של גדילים פתוחים = יותר זמן לפריימרים להיות פחות ספציפיים. 11. יש ניסוי בספר לקרוא 12. יש אנזימים שדורשים קו-פקטורים לפעילותם. לרוב קו-פקטורים אלו הם מולק' חיוביות כגון : Mg וכו'.. EDTAדג את המולק' האלו ומעכב את פעילות האנזים. 13. גן פגום ל-, Lac Z אחרת לא נדע מי קבלת את הפלסמיד. 14. Stringency החמרת התנאים כגון : טמפ' וריכוז מלחים לצורך העלאת הספציפיות. הורדת ריכוז המלח : הגברת הספציפיות, העלאת ריכוז המלח : הורדת הספציפיות. המלח מתחרה עם הדנ"א על הקישור במים ולכן בהעלאת ריכוז המלח הדנ"א שוקע וישנה פחות ספציפיות. שלב ד' ניקוי התוצר המוגבר הכנה לחיתוך עם אנזימי רסטריקציה לנקות את תוצר ה- PCR כמו שעשינו בשלב ב', עם השינויים הבאים : 50µl בופר קישור אילוציה של הדנ"א ב- 50µl מים שלב ה' חיתוך התוצר המוגבר חומרים תוצר מנוקה בופר חיתוך מים (יש להשלים ל- 100µl ריאקציה) Bglll Pstl כמויות 50 µl 10 µl 33 µl 4 µl 3 µl יש לשים לב שאת המחדר אנחנו חותכים עם אנזים שונה וזאת מכיוון שאחד מהאנזימים שחתכנו את הפלסמיד, חותך את המחדר באמצע. ניתן לחתוך את המחדר והפלסמיד עם אנזימים שונים בתנאי שנוצרים קצוות דביקים זהים. שאלות ע"מ 16 בכתב יד בריאקציות in vitro מתילציות לא מעניינות אותנו ואין סכנה שכזו. הוספת CIAP תגרום לכך שהמחדר לא יצריך ליצור קשר פוספו-די-אסטרי עם הפלסמיד. נוצרים אותם קצוות דביקים. ענינו כבר במעבדה הקודמת

7 שלב ו' ניקוי התוצר החתוך הכנה לליגציה כדלהלן לבצע ניקוי של המחדר כפי שביצענו קודם. יצירת 3 מבחנות : Insert מוכן לליגציה התוצר המנוקה. Insert לג'ל - 3µl מהמחדר הנקי + 14µl מים + 2µl צבע לדנ"א. Insert ל- OD 7µl - מהמחדר הנקי + 48µl מים. בדיקת O.D וקטור ng\µl = 1.8, \280 = 1.55, 260\230 אינסרט ng\µl = 1.74, \280 = 0.97, 260\230 תמיסה המכילה או DNA 50 µg מ 1 נקי ב-.260nm באורך גל ( OD=optical density "ל תמיסה מימית תבלע 1 יחידות בליעה units),au=absorbance היחס בין הבליעה ב- 280 nm לבין הבליעה ב- (260/280) 260 nm אמור להיות בין על הרחקה מספיק טובה של החלבונים, דרגת ניקוי טובה של ה-. DNA על מנת לדעת האם הרחקנו מספיק טוב מלחים, קרבוהידראטים, פנול כלורופורם וכו' מחושב היחס בין 260nmלבין (260/230) 230 nm הבליעה ב 320nm בדוגמא. שימו לב: בליעה נמוכה מ- למהול יותר מדי את דוגמת ה - והוא אמור להיות בין אמורה להיות מאד נמוכה, מבטאת פזור אור בדרך כלל על ידי חלקיקים הנמצאים וזה מעיד 0.05 יחידות בליעה באורך גל 260 נ"מ היא לחלוטין איננה מדויקת ולכן רצוי לא.DNA ובמידה וריכוז ה - DNAהוא נמוך מדי ואי אפשר לקרא בביופוטומטר אזי הדרך היחידה להערכת כמות היא על ידי הפרדה בג'ל אגרוז והשוואה כמותית למרקר מסחרי. שלב ז' הכנת ג'ל אגרוז 0.7% 0.7gr אגרוז + 100ml בופר TBEX1 +טריס EDTA (על מנת שהדנ"א לא יפורק בהרצה) --> חימום במיקרוגל לשם המסת האגרוז. להוסיף 4 µl אתידיום ברומיד. אתידיום הוא צבע פלורוצנטי הנקשר בקשרים חלשים לדנ"א. כאשר מאירים באור UV הוא פולט אור נראה. משתמשים בו על מנת לצבוע דנ"א. אתידיום היא מולק' חיוביות ולכן בזמן ההפרדה הוא יכול לנוע כלפי מעלה ולכן לעיתים חלקו התחתון של הג'ל הופך חסר אתידיום והדנ"א איננו נצבע (בעיקר כאשר מריצים מקטעי דנ"א קטנים מ- 1000bp ), ולכן הפתרון לזה הוא להוסיף בבופר אתידיום ברומיד. שיטה נוספת היא להריץ את הדנ"א ואח"כ לטבול את הג'ל באתידיום ברומיד. אתידיום ברומיד, מולק' קטנה. נכנס בין הבסיסים של הדנ"א. האינטראקציות הן יותר שליליות מאשר מטען. הקישור הוא הפיך. יש 3 אופציות לעבוד איתו : להכניס בבופר, להכניס בג'ל, לטלטל את הג'ל לאחר הרצה (כדי שיהיו קישור אחיד). האתידיום ברומיד טעון חיובית והוא נע לקוטב השלילי, הפוך מהתנועה של הדנ"א. אם כך חצי מהג'ל הולך ומתרוקן, דבר שיהיה בעייתי בהרצה של מולק' קטנות. וכדי שהצביעה תהיה אחידה עדיף לטלטל את הג'ל עם אתידיום ואז הצביעה יותר אחידה. הוא חומר פלורסנטי. יותר דנ"א יותר אתידיום נקשר.

8 הרצה של הג'ל פלסמיד KS וקטור חתוך מרקר nicked Super coild Super super coiled שאלות ע"מ הוסבר 2. התבצע חיתוך. 3. הוסבר 4. לא 5. לא 6. יוסבר בהמשך 7. יוסבר יחד עם. 6.8 הוסבר..9 הוסבר. 10. קשרים אלקטרו סטטים לא קוולנטים..11 הוסבר.?.12?.13?.14 הערכת ריכוזי הדנ"א ניתן לחשב את ריכוזי הדנ"א ב- 2 דרכים : ע"י הערכה מהג'ל.

9 ע"י יחס מולארי. אינסרט µl 210 ng \ וקטור µl 90 ng \ 13.4 ng 1µl 44µl (water) + 7µl (insert) 44\7 = \6.28 = µl 210 ng ng 1 µl 90 ng µl 48µl (water) + 7µl (vector) 48\7 = \6.85 = µl אלו הכמויות שיש לקחת. 69 \3 ng 1 µl 23 ng 1 µl 90 ng \3 ng 1 µl 51.3 ng 1 µl 210 ng 4 µl הערכה מג'ל יש לזכור שלקחנו 3µlתוצר להטענה בבאריות. בודקים לאיזה בנד במרקר הזריחה מתאימה. הזריחה(בבארית שהטענו את הפלסמיד) מתאימה ל- 3472bp שהם 69 ng של דנ"א. מכיוון שהטענו : 3µl הזריחה (בבארית שהטענו את האינסרט )מתאימה ל- 7743bp שהם 155 ng של דנ"א. מכיוון שהטענו : 3 µl השתמשנו בכמויות ביניים כפי שמוצג בטבלה בהמשך. שלב ח' ליגציה החומרים A להחדרה לחיידקים B להחדרה לחיידקים D להפרדה בג'ל C להפרדה בג'ל וקטור + מחדר בקורת וקטור בלבד וקטור +מחדר בקורת וקטור בלבד 2 µl בופר ליגאז 2 µl 2 µl 2 µl 3.3 µl וקטור 3.3 µl 3.3 µl 3.3 µl מחדר µl µl מים טהורים להשלים לנפח 10.6 µl 10.6 µl 10.6 µl 10.6 µl שלl 20 µ 1 µl אנזים ליגאז 1 µl 1 µl 1 µl 20 µl נפח ריאקציה סופי 20 µl 20 µl 20 µl לסרכז 10 שניות את המבחנות ולהדגיר ב- 16 C ללילה ואח"כ מכן ב 20 C- עד לשימוש הבא.

10 שאלות ע"מ הטמפ' האופטימאלית של ליגאז היא. 22 C אם נרצה לחבר קצוות blunt הרי שאלו קצוות שקשה לחבר ולכן נרצה שהליגאז יעבוד בצורה הכי אופטימאלית שלו (=22 C). כשנרצה לחבר קצוות דביקים יש להתחשב בעובדה שבטמפ' של 22 C למערכת יש יותר מידי אנרגיה ויהיה יותר קשה לגדילים להיצמד ולהתחבר ולכן נשתמש בטמפ' של. 16 C 2. עלולים להיכנס מס' מחדרים ואז הפלסמיד ייסגר על עצמו..3 מוסבר בשאלה אנחנו משתמשים בחיידק עם אקסונוקלאזות דפוקות..5. nicked פלסמיד כזה יכול להוביל לחיבור לא ספציפי יתכן ו- 2 פלסמידים יסגרו אחד על שני.6 רילקס =.7.8 ויתכן שיכנס יותר ממחדר אחד. אומנם פלסמיד כזה הוא בעל יעילות נמוכה יותר אבל עבדו איתו כי פחדנו שהפלסמיד ייסגר על עצמו. בדיקת ה- CIAP. בודק אם הפלסמיד נחתך ע"י אנזים אחד (אם כן הוא היה נסגר על עצמו) והיינו מקבלים מופע כחול ואילו זה נחתך עם 2 אנזימי רסטריקציה הפלסמיד לא היה נסגר על עצמו. PEG פולי אתילאן גליקול בעל קבוצות הידרוקסיל שיוצרות קבוצות עם המים ולכן מתחרות עם.9 הדנ"א על הקישור במים. הדבר גורם לסביבה הידרופובית באזור הדנ"א ובעצם מקרב בין גדילי הדנ"א ומעלה את יעילות הליגאציה. (לרוב משתמשים בקצוות (blunt.. 22 C 10. בופר ליגאז מכיל 2 דברים : ATP שלב ט' טרנספורמציה ליצירת קשר פוספו-די-אסטרי ו- 2+ Mg שהוא קו-פקטור לליגאז. A להכין סל קרח כל העבודה הזו תתבצע בקרח לוקחים 3 מבחנות המכילות חיידקים קומפטנטיים וציינים עליהן. A,B,KS חיידקים קומפטנטיים אלו חיידקים שטופלו המתכות דו ערכיות כדי להפוך את הממבראנה חדירה יותר לפלסמיד. חיידקים אלו מאוד רגישים ועלולים לעבור ליזיס מהיר מאוד, ולכן אסור לחמם אותם, העבודה היא סטרילית ובזמן עבודה עם החיידקים אסור לדבר. KS השלם נועד לבדיקת יעילות החיידקים הקומפטנטיים. 20µl 20µl 5µl B KS לתוך המבחנות מכניסים את נפח הריאקציה בהתאמה (חוץ מ- (KS.

11 ש, להדגיר 20 דקות ולא לעשות פיטטציה שכן החיידקים רגישים ויכולים לעבור ליזיס. לקחת 3 צלחות, LB+amp להכניס לכל צלחת : 100µl 50µl IPTG X-Gal ולייבש ב-. 37 C הכנה לזריעת החיידקים. את החיידקים יש להוציא מהקור ולהכניס ל- 42 C ל- 90 שניות. בתום ה- 90 שניות יש להחזיר לקרח. להוסיף LB 800µl סטרילי לתוך מבחנות החיידקים ולהדגיר לשעה. מטרת ה- LB הסטרילי הוא לשקם אותם ולתת להם לחיות מחדש והם אפילו מתרבים מעט. לסרכז את המבחנות להוציא את הנוזל העליון, להרחיף את החיידקים ולזרוע 100µl ומה- KS לזרוע. 20µl מדגירים ב- 37 C בחושך למשך 24 שעות. קיימות מס' שיטות לטרנספורמציה והשיטה היעילה ביותר היא האלקטרו פורציה הכנסת הדנ"א בעזרת מכת חשמל. השיטה מסובכת מכיוון שהכנת החיידקים קשה יותר, צריך לנקות את תערובת הליגאציה ממלחים שונים על מנת למנוע קצרים חשמליים ההורגים את החיידקים. כמו כן יש צורך בציוד מיוחד שכולל מבחנות,מכשיר וכו'.. חישוב יעילות החיידקים יעילות החיידקים בהגדרה מס' מושבות CFU אשר התקבלו מטרנספורמציה עם 1µl דנ"א. יעילות של CFU 10 משמעה 9 שמ- 1µl דנ"א התקבלו מיליארד מושבות חיידקים. יעילות החיידקים תלויה ב- 2 גורמים : חיוניות החיידקים (כיצד הוכנו? הגורם האנושי). מבנה הפלסמיד השלם אשר משמש אותנו לחישוב. יעילות הליגציה יעילות הליגציה תלויה בהרבה גורמים : יעילות החיידקים הקומפטנטיים. יעילות ופעילות האנזים ליגאז. איכות החיתוכים הן של הווקטור והן של האינסרט. האם מדובר בקצוות דביקים או בקצוות חלקים (הליגאז סוגר טוב יותר קצוות דביקים (. מידת הניקיון של הווקטור והמחדר. איכות ה-, PCR הופעת תוצרי לוואי לא ספציפים אשר יתחרו עם המחדר על הווקטור. הגורם האנושי טיפול בחיידקים קומפטנטיים שיצאו מהקפאה (פיטטציה הפוגעת בחיידקים (. שאלות ע"מ האנטיביוטיקה מבצעת סלקציה בין אילו שקיבלו את הפלסמיד לאילו שלא קיבלו את הפלסמיד. ורק התאוששות משוק החום יתפתח הגן. bla 2. כדי לראות שהמחדר לא נסגר על עצמו (כחול או לא כחול) איתם היו תקינים. - CIAP עבד, שהחומרים שהשתמשנו 3. ה- β לקטאמז עובר דיפוזיה במצע וזה גורם לפירוק האנטיביוטיקה, דבר שיכול להוביל להתיישבות חיידקים שונים. אלו הם מושבות לווין לרוב הם יהיו קטנות מהמושבות המרכזיות כי התחילו לגדול מאוחר יותר.

12 שרוב המושבות תהיינה לבנות. יתכנו מס' מושבות כחולות בגלל מקרים יוצאי דופן.? סיכוי קטן מאוד