שקופית 1

תמליל

1 מה עומד מאחורי בדיקת ה?Serum Free Light Chain ספטמבר 2012 ד"ר קלרה הניג מעבדה מחוזית נשר מחוז חיפה וג"מ

2 השימוש בבדיקת ה serum free Light chains נכנס לרוטינה של המעבדות הקליניות החל מ 2001 בעקבות המאמר, שבו נצפו רמות גבוהות של monoclonal FLC בסרום של 18 מתוך 29 חולי NSMM )באמצעות הקיט של.)TBS

3

4 יתרונות הבדיקה 1. רגישות אנליטית גבוהה יתרון בזיהוי NSMM Light Chain MM AL Amyloidosis )פחות ביופסיות מח עצם לאבחון ומעקב( זיהוי מוקדם של relapse אחרי טיפול / השתלה. 2. כמותית מאפשר מעקב אחר התקדמות מחלה / יעילות טיפול )Ig s קצר לעומת T 1/2 ( 3. אין בעיה של חלבונים מונוקלונאליים "נחבאים" )PEP(

5 Screening Screening SPE sif FLC SPE sif FLC UPE uif Stop investigation UPE uif If light chain amyloidosis is suspected

6 measurable disease כאחד מהמדדים ל sflc

7 תגובתיות לטיפול )במקרים בהם measurable disease הינו ה sflcבלבד (: CR negative immunofixation and normal sflc ratio VGPR 90% decrease in the difference between involved and uninvolved FLC PR - 50% decrease in the difference between involved and uninvolved FLC

8 מגבלות בדיקת Serum Free Light Chains No Standardisation and Traceability.1 להקמת מערכת של Traceability נדרשת היררכיה של שיטות וחומרי מדידה standard(.)gold standars to Field לשם כך יש לקבוע מהו ה measurand )האנליט שנמדד(? Measurand = FLC in serum FLC פוליקלונלי + מונוקלונלי = מגוון מולקולות של FLC No measurand

9 בעיית הרמוניזציה של תוצאות FLCבין מכשירים המודדים בשיטות שונות ( Immunonephelometry לעומת ) Immunoturbidimetry למרות השימוש באותו קיט מסחרי. Range R 2 Ref. Immage vs ProSpec Kappa Lambda mg/l mg/l Clinical Chemistry 49: (2003) Kappa mg/l Lambda mg/l Olympus vs SPAplus Kappa < 150 mg/l Lambda < 150 mg/l מעבדת נשר כללית 2011 SPAplus vs Integra 800 Lambda Kappa mg/l mg/l מרכז רפואי 2012 "העמק"

10 Lot to Lot Variation

11 תגובת חברת The Binding Site Rolling pools / Large pools

12 No. of lots Lab. CV mg/l N sflc Analyzer ם"במר 5.6% 3.8% Kappa Immage % 6.3% Lambda תיללכ רשנ Kappa Olympus Lambda 2 תיללכ רשנ Kappa SPAplus Lambda 1 תיללכ "קמעה" Kappa Intergra Lambda לילג-הירהנ יברעמ Kappa BN ProSpec Lambda םירקב תורידה Between run CV

13 בקרת איכות חיצונית

14

15 kappa Lambda

16 Feb 2012 Serum- Free kappa % Diff (from mean): % Serum- Free Lambda % Diff (from mean): %

17 Case A בן 58, ברקע.Multiple Myeloma אושפז ביולי 2012 עקב acute chronic renal failure משני להחמרה במחלתו הבסיסית.(MM) שוחרר לביתו לאחר טיפול במצב כללי טוב. ב 2006 היה )ע"פ בדיקה ברמב"ם( מעט IGG kappa +free kappa הדגימה נשלחה להשוואה במעבדת נשר )כללית(.

18 PEP - Capillarys IF-Hydrasis TP=7.03 gr/dl

19 IF: Kappa FLC M-Protein = ~9500 mg/l sflc: Kappa = 22,599 mg/l (Lambda FLC)= 9.69 mg/l שרשראות קלות חופשיות - הרצה בתוכנית של BJ polymerisation

20 הריאגנט = נוגדנים פוליקלונאליים נגד ה diversity C L - קומפלקסים שיוצרים הנוגדנים המונוקלונאליים Polymerization )בגלל ה )Variable region מגיבים עם הנוגדנים הפוליקלונליים שהינם M-Protein Overestimation of Serum K Free Light Chain Concentration by Immunonephelometry To the Editor: Clinical Chemistry 56:7 (2010) - אין התאמה לריכוז ה multi-reactivity Over estimation FLC באלקטרופורזה Analytical performance of the serum free light chain assay Clin Chem Lab Med 2010;48(1):73 79

21 2011 International Myeloma Foundation Extreme polymerization can cause an overestimation of light chains by as much as 10 fold

22 לינאריות המיהול: Non Linearity הנוגדנים המונוקלונליים בסרום מגיבים באופן שונה מאשר הנוגדנים הפוליקלונליים של הקליברטור

23 ב Immage 800 טבלה 3 דוגמאות לחוסר לינאריות המטולוגיה רמב"ם External dilution Date/sample Result after No dilution Result after X25 dilution Result after X500 dilution Fold difference K 31.5 K 507 K<6 (1 vs 25) L 87 L 131 (1 vs 25) L 54.2 L 119 (1 vs 25) K 157 K 723 K <6 (1 vs 25) K 94 L 135 K 174 L 107 (1 vs 25) L >144 L (25 vs 500) K 129 K (1 vs 25) K 88.8 K 153 (1 vs 25) K 52.7 K 157 (1 vs 25) 3 bold סומנה התוצאה שדווחה בסופטוב. ע"פ הנחיות החברה, אם ההבדל הוא עד פי 4, יש לדווח את התוצאה הפחות מהולה. אם ההבדל גדול מפי 4 יש לבדוק antigen excess ואם יש, לדווח את התוצאה בדגימה המהולה

24 Linearity on SPAplus off-line dilution value dil *5 dil *10 dil *50 kappa %recovery Lambda %recovery

25 סיבה אפשרית ל :non linearity בתחום המדידה range( )measuring מתקיים מצב של excess" "antigen ל monoclonal FLC הם מכירים רק נוגדן אחד ספציפי בתוך התערובת הפוליקלונלית ונוגדן זה נמצא בכמות מוגבלת בתוך כלל הנוגדנים. כיצד להתמודד עם ה :non-linearity 1. להצמד למיהולים המומלצים של המכשיר 2. להשתמש במיהולים שאינם חופפים בטווח תלוי מכשיר. BNII( לעומת )SPA 3. "הערך הנכון" = הערך שנקבע ב- 2 מיהולים עוקבים 4. לדווח את הערך ה- 1 שמתקבל בתחום המדידה תוך התעלמות מתופעת ה non linearity

26 גבר בן 60 )דגימה ( במעקב של המרפאה ההמטולוגית: תוצאה )Olympus( 1 Kappa FLC <5.4 mg/l Lambda FLC < 6.3 mg/l בהיסטוריה: ImmunoFixation= Lambda Free :)1:100( בדיקת על חזרה Lambda במיהול חיצוני Kappa FLC <5.4 mg/l Lambda FLC mg/l

27 התראת Antigen excess על מכשיר ה SPAplus Kappa (mg/l) Flag פעולה מיהול 10* )התחלתי( P (antigen excess) Auto dilution 22, * תוצאה סופית no

28 Case I A 68 YR old woman Diagnosed with smoldering myeloma since 2010 Referred to RMC due to suspected disease progression based on FLC results No organ damage Feels well Does she really have a rapid increase in FLC requiring therapy?

29 Differences in the serum free Lambda results between RMC and community lab. Date Institution Instrument Free Lambda (mg/l) 15/12/2011 Community Health Services Olympus /2/2012 Rambam Immage /3/2012 Community Health Services Olympus /4/2012 Rambam Immage /4/2012 Community Health Services SPA 3033 הבדל משמעותי? החמרה?

30 Biological Variation the natural fluctuation of body fluid constituents around the homeostatic setting point, has two kinds of variation: Between subjects Within subject

31 Biological Variation Clin chem 49:8 p , 2003 נבדקים 10 בריאים עם תפקודי כלייה תקינים 23-50Y(,)5 M, 5 F, age 2 דגימות מכל נבדק )הפרש של 8 ימים( כל הדגימות נבדקו בהרצה אחת. מכשיר : ProSpec BN Intraindividual Variation (CV I ): 8/10 (K, L, ratio) <2.5% 2/10 )ratio) : 7-8%

32 Clinical Chemistry 57:12, , 2011 נבדקים איסוף נתונים רטרוספקטיבי )5 שנים( 158 חולים יציבים קלינית MM MGUS, SMM, לא קיבלו טיפול במהלך 5 שנים אין שינוי באבחנה השינוי ברמת ה M-protein < 0.5 gr/dl לפחות 3 דגימות חוזרות )3-16(. התקיים לפחות 1 מתוך 3 הקריטריונים ל :measurable disease SPEP: M-spike 1 gr/dl UPEP M-spike 200mg/24h iflc 100mg/L + ratio FLC (out of ref. range) המכשיר: BNII Involved FLC (iflc) : biological CV= 27.8%

33 RCV = Reference Change Value RCV= * Z * (CV 2 A +CV I2 ) =Z מובהקות. 95% ההבדל משמעותי 2.58=Z מובהקות 99%. ההבדל משמעותי ביותר שינוי משמעותי בסבירות של 95% בערך ה iflc )מעל )CVa=5.8%,100mg/L צריך להיות לפחות 78.7%

34 איך זה מסתדר עם הנחיות המעקב אחר תגובתיות לטיפול? Criteria for diagnosis, staging, risk stratification and response assessment of multiple myeloma SV Rajkumar and RA Kyle Leukemia January; 23(1): 3 9. Response assessment using the serum FLC assay The serum FLC assay criteria come into play only in patients who do not have evidence of measurable disease. measurable disease is defined as serum M protein 1 g/100 ml or urine M protein 200 mg per 24 h. The FLC assay is not to be used for response assessment in patients who have evidence of measurable disease in the serum or urine. In addition, the baseline level of the involved FLC should be at least 10 mg/l and the FLC assay should have an abnormal ratio...

35 Response Criteria for FLC Minimum deemed measurable PR CR scr Progression AL without measurable serum or urine M- protein iflc100 < mg/l 50% reduction of iflc Normal rflc and CR by IFE and bone marrow ND 50%increase of iflc to > 100 mg/l AL with measurable serum or urine M- protein ND ND ND ND ND MM without measurable serum or urine M- protein iflc100 < mg/l and rflc abnormal 50% reduction of dflc ND Normal rflc & CR by IFE and bone marrow 50%increase of dflc MM with measurable disease Use of FLC not recommended Use of FLC not recommende d Use of FLC not recommende d Normal rflc & CR by IFE and bone marrow Use of FLC not recommende d

36 Date Institution Instrument Free Lambda (mg/l) 15/12/2011 Community Health Services Olympus /2/2012 Rambam Immage /3/2012 Community Health Services Olympus /4/2012 Rambam Immage /4/2012 Community Health Services SPA %

37 סיכום: הבדלי ביצועים בין מכשירים ( הדירות שונה, העדר הרמוניזציה( ערכים שונים של FLC ו FLC ratio הפרעה למעקב אחר החולה יש לעקוב באותה המעבדה ובאותו המכשיר antigen excess, non linearity פולימריזציה, over or under estimation שימוש ואינטרפרטציה מושכלים של המיהולים Biological variability גבוה של iflc יש להתחשב בעת המעקב והחלטה על מידת ה response/progression של המחלה

38