משרד החקלאות - דו"ח לתוכניות מחקר

תמליל

1 משרד החקלאות - דו"ח לתוכניות מחקר להנהלת ענף בקר קוד זיהוי א. נושא המחקר )בעברית( פיתוח ושימוש באמצעים מולקולריים חדשניים לניטור של נגיפים אלימים ל בקר בפרוקי רגליים ב. צוות החוקרים שם משפחה חוקר ארסטר ראשי חוקרים משניים 1 בכר 2 שטרם שם פרטי אור ן עדי יהודה ג. כללי מוסד מחקר של החוקר הראשי המכון הווטרינרי ע"ש קמרון תאריכים סוג הדו"ח תקופת המחקר עבורה מוגש הדו"ח שנתי סיום התחלה חודש שנה חודש שנה 12 / / 2017 תאריך משלוח הדו"ח למקורות המימון שנה חודש 02 / 2019 ד. מקורות מימון עבורם מיועד הדו"ח שם מקור המימון הנהלת ענף הבקר המכון הווטרינרי קוד מקור מימון סכום שאושר למחקר בשנת תיקצוב הדו"ח בשקלים 75,000 80, ה. תקציר שים לב - על התקציר להיכתב בעברית לפי סעיף ה' שבהנחיות לכתיבת דיווחים מטרת מחקר זה היתה לקבל "תמונת מצב" של התכולה הנגיפית ביתושים ויבחושים בסביבת בקר וצאן virome( )Insect וזאת על מנת לזהות פתוגנים פוטנציאליים עוד בטרם מתרחשים אירועי הדבקה ותחלואה. נדגמו מספר אתרים בהם נלכדו יתושים ויבחושים, אשר מוינו מורפולוגית ולאחר מכן שימשו להפקת חומצות גרעין. בהמשך שימש ה- RNA שהופק לביצוע ריצוף עמוק analysis( )Deep sequencing, NGS בו אותרו רצפים שעשויים להשתייך לנגיפים. רצפים אלה נבדקו מבחינת חזרתיות וכמות, ובוצע ניתוח שלהם לפי מין הנגיף המשוער וקבוצות מאחסנים. בוצע ריצוף עמוק לשבע קבוצות, שנבחרו לפי מיקום, או מין וזמן לכידה. הקריטריונים לביצוע הריצוף והניתוח נשמרו זהים עבור שתי ההרצות, כך ששבע קבוצות הדיגום )3 מהשנה השניה ו- 4 מהשלישית( נבדקו יחד. מתוך כלל הרצפים שנבדקו )כ- 6,000,000( זוהו כ קריאות שמקורן בגנומים נגיפיים.)hits( הקריאות שהתקבלו סוננו כך שרק 10 קריאות או יותר עבור מין אחד בקבוצה אחת, נחשבו כזיהוי מהימן ושימשו להמשך הניתוח. על פי סינון זה זוהו 166 מיני נגיפים שונים, שסווגו לפי מין המאחסן וקבוצת הדיגום. נערכה השוואה בין הקבוצות השונות ונבדקה החפיפה בזהות המינים ביניהן. בהמשך בוצע ניסיון לבצע אימות לתוצאות הריצוף העמוק. הניסיון לאתר נוכחות חומר גנטי של נגיפי הרפס ו- Encephalomyocarditis באמצעות PCR נכשל. לעומת זאת, זוהה ה- RNA של נגיף מקבוצת,Simbu שנוכחותו זוהתה בבדיקת הריצוף העמוק. בנוסף, פותחה מערכת אבחון המאפשרת זיהוי נגיף קדחת שלושת הימים )BEFV( מדגימות חרקים. התוצאות עד כה מראות כי לאיפיון ה- virome של חרקים )ולא רק חרקים( בסביבת הבקר והצאן חשיבות רבה, אבל נדרש היקף גדול יותר של בדיקות על מנת ליצור תמונה מקיפה ומהימנה של מיני הנגיפים בסביבה זו.

2

3 1 דו"ח סופי לתכנית מחקר מספר פיתוח ושימוש באמצעים מולקולריים חדשניים לניטור של נגיפים אלימים ל בקר בפרוקי רגליים Development and utilization of novel molecular tools for field surveillance of beef viral pathogens in arthropods דו"ח התקדמות עבור שנת מוגש להנהלת ענף הבקר ע"י אורן ארסטר עדי בכר יהודה שטרם החטיבה לווירולוגיה, המכון הווטרינרי ע"ש קמרון החטיבה לפרזיטולוגיה, המכון הווטרינרי ע"ש קמרון החטיבה לווירולוגיה, המכון הווטרינרי ע"ש קמרון תקציר מטרת מחקר זה היתה לקבל "תמונת מצב" של התכולה הנגיפית ביתושים ויבחושים בסביבת בקר וצאן ( Insect )virome וזאת על מנת לזהות פתוגנים פוטנציאליים עוד בטרם מתרחשים אירועי הדבקה ותחלואה. נדגמו מספר אתרים בהם נלכדו יתושים ויבחושים, אשר מוינו מורפולוגית ולאחר מכן שימשו להפקת חומצות גרעין. בהמשך שימש ה- RNA שהופק לביצוע ריצוף עמוק analysis( )Deep sequencing, NGS בו אותרו רצפים שעשויים להשתייך לנגיפים. רצפים אלה נבדקו מבחינת חזרתיות וכמות, ובוצע ניתוח שלהם לפי מין הנגיף המשוער וקבוצות מאחסנים. בוצע ריצוף עמוק לשבע קבוצות, שנבחרו לפי מיקום, או מין וזמן לכידה. הקריטריונים לביצוע הריצוף והניתוח נשמרו זהים עבור שתי ההרצות, כך ששבע קבוצות הדיגום )3 מהשנה השניה ו- 4 מהשלישית( נבדקו יחד. מתוך כלל הרצפים שנבדקו )כ- 6,000,000( זוהו כ קריאות שמקורן בגנומים נגיפיים.)hits( הקריאות שהתקבלו סוננו כך שרק 10 קריאות או יותר עבור מין אחד בקבוצה אחת, נחשבו כזיהוי מהימן ושימשו להמשך הניתוח. על פי סינון זה זוהו 166 מיני נגיפים שונים, שסווגו לפי מין המאחסן וקבוצת הדיגום. נערכה השוואה בין הקבוצות השונות ונבדקה החפיפה בזהות המינים ביניהן. בהמשך בוצע ניסיון לבצע אימות לתוצאות הריצוף העמוק. הניסיון לאתר נוכחות חומר גנטי של נגיפי הרפס ו- Encephalomyocarditis באמצעות PCR נכשל. לעומת זאת, זוהה ה- RNA של נגיף מקבוצת,Simbu שנוכחותו זוהתה בבדיקת הריצוף העמוק. בנוסף, פותחה מערכת אבחון המאפשרת זיהוי נגיף קדחת שלושת הימים )BEFV( מדגימות חרקים. התוצאות עד כה מראות כי לאיפיון ה- virome של חרקים )ולא רק חרקים( בסביבת הבקר והצאן חשיבות רבה, אבל נדרש היקף גדול יותר של בדיקות על מנת ליצור תמונה מקיפה ומהימנה של מיני הנגיפים בסביבה זו.... הצהרת החוקר הראשי: הממצאים בדו"ח זה הינם תוצאות ניסויים. הניסויים מהווים המלצות לחקלאים: כן/לא. חתימת החוקר תאריך

4 2 תוכן העניינים מבוא ותיאור הבעיה... מטרות המחקר... חומרים ושיטות... תוצאות... דיון... רשימת ספרות מבוא ותיאור הבעיה משק הבקר בישראל מאויים תמידית ע"י פתוגנים שונים והנזקים הישירים הנגרמים לו עקב מחלות מדבקות מגיעים למיליוני ש"ח בשנה. יתרה מזאת, האיסור על ייצוא בע"ח ומוצריהם בעקבות אירועי תחלואה מוגדרים מגדילים עוד יותר את הנזק הנגרם למגדלים ולמדינה. למרות שטח המחיה המצומצם יחסית למדינות אחרות, הבקר בישראל חשוף למגוון פתוגנים רחב, הנבדלים באופן ההעברתם, באלימות ובדרכי המניעה והטיפול שלהם 2013). (H. Yadin et al. 2006, Brenner et al. 2010, Stram et al. 2008, Amitai et al. 2011, Elad בשנים נרשמו 271 מקרים של קדחות )בבזיוזיס ותיילריוזיס(, 617 מקרים של מחלות חיידקיות (anthrax, salmonellosis), botulismומספר Q fever, האירועים הרב ביותר )760 אירועים(, היה של מחלות נגיפיות )קטרת העור, כחול הלשון) BEV,FMD) BLV,,דו"ח השו"ט 2012(. רישום זה מתייחס למוקדי התפרצויות, כאשר מספר אירועים בישוב אחד, או יותר מאירוע/שנה כך שמספר המקרים בפועל גבוה יותר. כמו כן, אין התייחסות למספר החיות שנפגעו בכל אירוע. למרות ריבוי המקרים וריבוי מיני הפתוגנים שפוגעים בצורה משמעותית בבקר בישראל, מרבית הניטור והזיהוי של נוכחות הפתוגנים ברפת ובשדה בוצע עד כה לאחר שאירעו מקרי תחלואה ותמותה, ולאחר שהמחלה התפרצה והתפשטה, כולל מחלות זואונוטיות. אין כיום בישראל ניטור סדיר מקדים בסביבת הבקר, שמזהה איומים פוטנציאליים לפני התרחשות הדבקה והתפשטות. הכלים המולקולריים האבחוניים שפותחו במכון הווטרינרי וכן אלו אשר נמצאים בתהליכי פיתוח במכון הווטרינרי, מאפשרים זיהוי רגיש וספציפי מאד של חלק מהפתוגנים מהקבוצות שהוזכרו לעיל (Davidson and Braverman 2014). al. 2005, Brenner 2010, Erster et al. 2013, Menasherow et עם זאת, טרם בוצעה בדיקה מקיפה של נוכחות פתוגנים אלה בסביבת הבקר, ברפת או במרעה אלא לאחר התפרצות או עליה בתחלואה ותמותה. הבעיה: יש קושי לזהות את הפתוגנים שמצויים בסביבת הבקר, בפרט את הפתוגנים הנגיפיים ברפת ובמרעה, כאשר הם בשלב שלפני ההתפרצות או, אם מדובר בפתוגנים המועברים ע"י פרוקי רגליים, כאשר הם מאלחים את המעביר ועדיין לא הדביקו את הבקר. ידוע כיצד מועברות מספר מחלות, כגון נגיפי BTV, EHD, FMD, Akabane

5 3 אולם חסר מידע לגבי העברת מחלות כגון קטרת העור ונגיף, Schmallenberg ואין תמונה מעודכנת לגבי הפתוגנים שכן ידוע כיצד הם מועברים. יתרה מכך, לגבי מחלות רבות אין כיום מידע שמאפשר היערכות מקדימה, וברוב המקרים אין מידע כלל לגבי נוכחות פתוגנים בקרבת הבקר, טרם מתרחשת התפרצות או עליה בתחלואה. כפועל יוצא, אין היערכות מקדימה בהיבטים שיכולים להפחית את התחלואה והתמותה, כגון ממשק רעיה, הדברה, וטיפול בפסולת, היערכות אשר מבוססת על המצב בשדה. גם חיסונים שניתנים באופן גורף לא מספקים תמיד מענה הולם לבעיות בשדה, בשל היעדר מידע על הפתוגנים שמצויים באזור ספציפי בזמן ספציפי. 2. מטרות המחקר מטרת המחקר הינה ליצור תמונת מצב של נוכחות נגיפי Arbo הגורמים למחלות כחול הלשון, קטרת העור,,BEV לפני התרחשות התפרצות. זאת על מנת לאפשר נקיטת צעדי מנע בטרם נגרם נזק משמעותי. יעדי המחקר: 1. פיתוח אמצעים מולקולריים חדשים בנוסף על הקיים, על מנת להרחיב את טווח הזיהוי ולשפר את האמצעים הקיימים, על בסיס הדגימות מהשדה. 2. שימוש בכלים החדשים שיפותחו לזיהוי נגיפים בסביבת הבקר )פרוקי רגליים, מים ומזון( לשם יצירת תמונת מצב עתידית של איומים פוטנציאליים על משק הבקר הישראלי. 3. יצירת תשתית לדיגום ובדיקה מתמשכים שיאפשרו נקיטת צעדים מתאימים לאורך כל השנה, באזורים מועדים להתפרצויות.

6 4 3. עיקרי החומרים והשיטות 3.1. לכידת חרקים מעופפים הלכידה בוצעה באמצעות מלכודות סטנדרטיות מסוג (CDC) John Hock ובאמצעות שני סוגי מלכודות שפותחו במכון הווטרינרי: אחת ע"י פרופ' יהודה ברוורמן ואלכסיי גינזבורג והשנייה ע"י ד"ר עדי בכר. מיקום המלכודות נבחר על פי מיני המטרה, באופן הבא: על מנת ללכוד יתושים +Aedes( )Culex נעשה שימוש במלכודות בתוספת COבגובה מ', כאשר המלכודת מוקמה 20 מ' לפחות ממקום רביצת הפרות. ללכידת מיני Culicoides נעשה שימוש במלכודות (UV) Black light בגובה מ', בסמוך למקום רביצת הפרות. המלכודות הופעלו בשעות אחה"צ ואיסוף החומר בוצע בשעות הבוקר המוקדמות. החרקים החיים הועברו למכון הווטרינרי להמשך טיפול תוך כדי שמירה על שרשרת קור זיהוי טקסונומי הזיהוי הטקסונומי בוצע על פי מאפיינים מורפולוגיים יחודיים לכל מין, בסיוע מגדירים ובסיוע היחידה האנטומולוגית במשרד הבריאות, כאשר החרקים חיים במידה והדבר היה אפשרי. לאחר המיון קובצו הפרטים מאותו מין בקבוצות של עד 50 פרטים לביצוע הפקת חומצות גרעין. כמו כן פותחה שיטה לקבלת ברקוד מולקולרי המבוסס על גן נוקלארי )CAD( וגן מיטוכונדריאלי )COI( לזיהוי מולקולרי של החרקים כיול הפקת חומצות גרעין נגיפיות מחרקים על מנת לבדוק את יעילות הפקת RNA מחרקים, בוצע spiking עם RNA של נגיף BEF להפקת RNA מיתוש pipiens( )Culex ומיבחוש ( circumscriptus )Cullicoides באמצעות שיטות הפקה שונות, כמתואר להלן: הושוו שלוש שיטות הפקה באמצעות ערכות הפקה ייעודיות הבאות: : )Madison, WI, USA( Epicentre מחברת MasterPure )I )Birkenfeld, Germany( Stratec מחברת InviSorb )II )Gyeonggi-do, Korea( intron מחברת Viral Gene-spin )III ההפקות בוצעו על פי הנחיות כל יצרן. ה- RNA המופק שימש לסינתזת cdna כאשר בשלב זה בוצעה השוואה בין שני מוצרים: Verso cdna synthesis Beverly, MA, ( Quanta מתוצרת חברת qscript cdna Synthesis Kit ו- Thermo Fisher Scientific מתוצרת kit.)usa ה- cdna שיוצר שימש לביצוע qpcr לגילוי BEF ובהשוואת התוצאות נבדקה רגישות וספציפיות הריאקציה עבור כל הפקה. הפקת RNA לריצוף מטא-גנומי עמוק בוצעה באמצעות הערכה מתוצרת Intron Bio או באמצעות )Gibco( Trizol כאשר בוצעו שלושה מיצויים עוקבים של RNA עם פנול כלורופורם לקבלת RNA ללא DNA וללא מזהמים כימיים מתהליך ההפקה. לשם ריצוף מטא-גנומי השוואתי נבדקו שלושה מקבצים )pools( לפי החלוקה הבאה: מקבץ

7 5 אחד של יבחושים spp.( )Culicoides מאתר יחיד, מקבץ אחד של התפרצויות של מחלות נגיפיות,)hotspots( ומקבץ אחד של יתושים spp.(.)culex Culicoides ממספר אתרים שבעבר אירעו בהם 3.4. כיול בדיקת RT-qPCR לזיהוי נגיפים בדגימות חרקים בשל הרקע הגבוה של חומר גנטי בהפקת ח. גרעין מחרקים, בוצעה השוואה בין שלושה זוגות פריימרים ושלוש ערכות )kits( להפקת ח. גרעין: )www. intronbio.com( intron,) Epicentre ו- Stratec.) ההפקות בוצעו על פי הוראות היצרן בכל ערכה. תוצרי ההפקות שימשו לביצוע סינתזת גדיל DNA משלים )cdna( באמצעות ) Verso cdna synthesis kit ולאחר מכן לביצוע.qPCR הרגישות והספציפיות של כל ריאקציה הושוו ע"י בדיקת מספר מחזורי ההגברה )Cq( ועקומות ההמסה curves( )melt שהתקבלו לאחר ההגברה בכל בדיקה. הריאקציות בוצעו במכשיר.Bio-Rad CFX ביצוע אנליזת Deep Sequencing לדגימות שנאספו ה- RNA שהופק נשלח למעבדת ריצוף המתמחה בריצוף עמוק של מיקרואורגניזמים. לאחר בדיקת איכות ה- RNA על מנת לוודא שאפשר לבצע ריצוף עמוק של הדגימות, בוצע ריצוף של כל ה-,RNA ללא סינון מוקדם. הריצוף בוצע במכשיר Illumina MiSec והתקבלו כ- 100 מיליון קריאות רצף באיכות גבוהה אשר מאפשרת ניתוח בשלב הבא בוצע ניתוח ביואינפורמטי לרצפים שהתקבלו, לפי השלבים הבאים: 1. Data reduction of raw reads based on sequence similarity, followed by BLASTX mapping to identify proportion of host, viral, and bacterial sequences 2. Mapping of raw reads directly against viral database 3. De novo assembly of a subset of the data to identify likely host rrna sequences הקריאות שזוהו כשייכות לרצפים נגיפיים )"hits"( נספרו ונבדק מספר הקריאות של אזורים שונים בגנום עבור כל מין של נגיף שזוהה coverage(.)genomic הנתונים נאספו בטבלאות עבור כל דגימה שנבדקה ביצוע בדיקות תיקוף )validation( לתוצאות אנליזת NGS הקריאות שהתקבלו באנליזת NGS ושויכו לנגיפים מוינו לפי מין הנגיף, ומינים שהתקבל עבורם מספר קריאות גבוה נבחרו לבדיקת ה- validation ע"י תכנון ויצירת בדיקת RT-PCR בהתבסס על הגנום השלם או על רצפים ששובטו בהצלחה ודווחו בספרות. על בסיס ניתוח תוצאות הריצוף הגמנומי תוכננו ויוצרו פריימרים ספציפיים לנגיפים שזוהו באנליזת ה-,NGS ובוצע ניסיון לזהות את הנגיפים באמצעות.PCR

8 6 4. תוצאות 4.1. לכידת וזיהוי חרקים מעופפים בסביבת הרפת בוצעו לכידות בשבעה אתרים: רפת מצר, תחנת הסגר דור, רפת לוטן, רפת פארן, רפת אשדות יעקב, רפת שדות ים, רפת וולקני )בית דגן(. נלכדו מעל עשרת אלפים פרטים בסך הכל שזוהו כמפורט בטבלה 1. זוהו Cu. Cu. schultzei grp, Cu. imicola, Cu. Punctatus, Cu. Newstiadi, מיני היבחושים )Cullicoides( הבאים:,.destictipennis, Cu. Circumscriptus, כמו כן זוהו מיני היתושים: Cu. longiareolata, Cu. puncticollis )זבובי חול(, וזבוב הבקר Phlebotomus,Culex pipiens Aedes Caspius, Aedes detritus זבובים מהסוג.Stomoxys calcitrans מינים Cu. schultzei grp, Cu. imicola, Cu. punctatus, Cu. newstiadi, Cu. Destictipennis, Cx. pipiens, Phlebotomus ssp. Cu. schultzei grp, Cu. imicola, Cu. punctatus, Cx. Pipiens, Ae. Caspius, Ae. detritus, Phlebotomus ssp. Cu. imicola Cu. imicola Cu. circumscriptus, Cu. imicola, Cu. punctatus Cu. imicola, Cu. newstiadi, Cx. pipiens, Ae. Caspius, Ae. detritus, Cu. longiareolata Cu. schultzei grp, Cu. imicola, Cu. punctatus, Cu. circumscriptus, Cu. destictipennis, Cu. puncticollis, Cx. pipiens, Ae. Caspius, Cu. Longiareolata, Phlebotomus ssp, S. calcitrans מיקום הלכידה רפת מצר תחנת הסגר דור רפת לוטן רפת פארן רפת אשדות יעקב רפת שדות ים רפת וולקני )מ נהל המחקר( טבלה 1. מיקומי נקודות הלכידה והמינים שזוהו בכל מלכודת..Cx-Culex,Cu Cullicoides 4.2.כיול מערכת זיהוי מולקולרית לנגיף BEF בחרק בכדי לכייל את התנאים המיטביים לגילוי BEF בחרק, נבדקה תחילה היעילות של שלושה זוגות פריימרים בריאקצית SYBR qpcr )איור 1 א(. בוצעו בדיקות רגישות וספציפיות לזוג שנבחר כאשר תוצר PCR מנוקה בריכוז ידוע שימש כתבנית )איור 1 ב(. הזוג הנבחר שימש להשוואה בין שתי שיטות סינטזת ה- cdna. בחינת איכות הפקת ה- RNA באמצעות שלוש ערכות ההפקה שנבדקו. השוואת שיטות הסינטזה הראתה כי השימוש בתערובת Verso עדיף ומוצר זה נבחר לשמש בסינטזת cdna כללית בהפקות הבאות )איור.)1A,1B לאחר בחירת תערובת סינתזת ה- cdna נערכה השוואה בין מערכות הפקה שונות, אשר נבדקו עם מיצויים מיבחוש circumscriptus( )Cu. ויתוש pipiens( )Cx. שבוצע להם spiking עם RNA של נגיף ה- BEF )איור 2(. גם בהשוואה זו נבדקו היעילות והרגישות של ריאקציית RT-qPCR עם כל הפקה, ונמצא כי ערכת ההפקה של חברת intron נתנה את התוצר המתאים ביותר ערכי ה- Cq שהתקבלו משלוש הדוגמאות היו הגבוהים

9 7 ביותר. ערכה זו נבחרה לכן לשמש להמשך הניסויים. כמו כן, בדיקות הכיול אישרו שאכן אפשר לבצע הפקת RNA נגיפי מהחרקים הנבדקים ולגלותו בשיטות שנבדקו. תוצאות ה- qpcr הראו כי קיים תוצר לא ספציפי, כנראה משום שהפריימרים הנבחרים מגבירים גם מקטע בחרק. לכן פותחה ראקציית nested PCR בה הוגבר מקטע של 700bp מנגיף ה- BEF ועליו בוצעה בדיקת ה- qpcr לקבלת תוצאות אופטימליות. איור 1. בדיקת איכות תוצרי סינטזת cdna כללי מהפקת RNA מחרקים. נבדקו שני מוצרים כמפורט בסעיף 4.2. בדיקת BEF qpcr בוצעה עבור כל מוצר ונבדקו כמות החומר המיוצר )A, )robustness ודיוק הסינתזה כפי שמתבטא בעקומת ההמסה המתקבלת לאחר ה- A(.)specificity )B, PCR ככל שכמות ה- cdna ההתחלתית רבה יותר, ההגברה מתחילה בשלב מוקדם יותר Cq( נמוך יותר(. )B( בדיקת ספציפיות הסינתזה בוצעה ע"י השוואת עקומת ההמסה curve( )melt של כל ריאקציה לזו של ה- DNAהמנוקה. עקומת המסה עם "peak" בטמפ' 76 C משמעה סינתזה ספציפית.

10 8 A Sample Cq epi C epi C+ N/A epi cmsript epi cmsript epi pipiens epi pipiens Control Cx. pipiens Cu. circumscriptus B Sample Cq intron C intron C int crcumscript int crcumscript int pipiens int pipiens Control Cx. pipiens Cu. circumscriptus C Sample Cq stratec stratec stratec stratec str crcumscript str crcumscript str pipiens str pipiens Control Cx. pipiens Cu. circumscriptus Control איור 2. השוואה בין יעילות מערכות הפקה שונות לקבלת RNA נגיפי. בוצעה הפקת RNA מיבחוש או יתוש, לאחר spiking עם RNA של,BEF לאחר מכן סונתז cdna ונוכחות ה- RNA הנגיפי נבדקה באמצעות Cu. הפקה מ- - epi cmsript נגיף תרכיב מרוכז, - C+ :Epicentre בדיקת מערכת הפקה )A(.qPCR RNA עם spiking לאחר Cx. pipiens הפקה מ- - epi pipiens נגיפי, RNA עם spiking לאחר Circumscriptus נגיפי. )B( דגימות זהות לאלה שנבדקו ב-) A ( לאחר הפקה עם מערכת מתוצרת )C(.)int( intron דגימות זהות לאלה שנבדקו ב- A ו- B, עם מערכת הפקה מתוצרת.)str( Stratec

11 ריצוף דגימות משלוש קבוצות )pools( של יבחושים ויתושים בהרצת הריצוף הראשונה הוכנו שלוש דגימות RNA שהכילו כל אחת 50 פרטים של spp. Culicoides או של Culex.spp. ה- RNA נבדק באמצעות BioAnalyzer ונקבע ערך )RNA integrity number( RIN שעומד בדרישות בדיקות הריצוף )איור 3(. בוצעו לקריאות שהתקבלו שני ניתוחים מקבילים: BLAST-based CLUXTALX ו- Bowtie כנגד בסיס נתונים נגיפי. בבדיקת הריצוף העמוק זוהו מעל ל קריאות ממקור נגיפי, מתוכן כ- 30 עם מספר רב של "hits" או מינים בעלי חשיבות )טבלה 2(. איור 3. בדיקת איכות הפקת ה-.RNA לאחר בדיקת הרצה בג'ל וכימות ה- RNA בגדלים שונים, חושבו ערכי RIN עבור כל דגימה, ונקבעו בין 2.2 ל ערכים אלה מצביעים על איכות טובה מספיק לביצוע בדיקת הריצוף העמוק. Group No. of total hits 1 (KVI Cullicoides) (hotspot Cullicoides) mosquitos 465 Total (All 3 combined) 1084 טבלה 2. התפלגות הקריאות שזוהו כשייכות למקור נגיפי בין שלוש הדגימות שנבדקו ב-.RNA Seq 4.4. התפלגות ה- hits )קריאות חיוביות ממקור נגיפי( לפי קבוצה ולפי מאחסן בסה"כ זוהו בין 525 ל- 633 מינים בשתי קבוצות יבחושים, וכ- 460 מינים בדגימה של יתושים )טבלה 3(.

12 10 לאחר זיהוי הרצפים ממקור נגיפי חולקו 160 הקריאות המהימנות ביותר )על פי מספר הקריאות למין נגיף או על פי ה- )Species genome coverage לפי קבוצות מאחסנים פוטנציאליים ונמצא כי הקבוצה הגדולה ביותר עבור 4(. בדיקת שלוש הדגימות היתה יונקים )טבלה 3(. קבוצות קטנות יותר היו של חיידקים, עופות ודגים )איור החפיפה ב- 160 הקריאות שנבחרו בשל מספר קריאות גבוה ו/או genome coverage טוב, הראתה כי היו 28 מיני נגיפים שנדגמו בכל שלושת המקבצים. השוואה בין שתי דגימות היבחושים הראתה חפיפה של 19 מינים שזוהו 17 בשתיהן. בנוסף היו 8 מינים שזוהו רק במקבץ היבחושים מאתרים בהם דווח בעבר על התפרצויות, מינים שזוהו רק במקבץ היתושים מאתר יחיד, ו- 9 מינים שזוהו רק ביתושים )איור 5(. בדיקת זהות הנגיפים שזוהו בכל שלוש הקבוצות )28 מינים, טבלה 3, איור 5(, הראתה במקרים רבים שזוהו נגיפים ממקור אנושי או נגיפי דגים )טבלה 3(. יחד עם האפשרות שאכן החרקים שנדגמו הכילו נגיפים ממקורות אלו, סביר גם כי בסיסי הנתונים ששימשו לניתוח התוצאות הכילו רצפים דומים, אך לא זהים, לרצפים שהופקו מהדגימות שנלכדו. לכן יתכן שהקריאות שזוהו כנגיפי הרפס אנושים או הרפס קופים )טבלה 3( הם נגיפי הרפס של בקר או סוסים, אבל מכיוון שלא נחקרו ורוצפו, הרצפים הקרובים להם ביותר בבסיס הנתונים, הם אלה שזוהו לכאורה. Mammalian Aotine herpesvirus 1 strain S34E Bovine herpesvirus 1e Bovine herpesvirus 5 Chimpanzee alpha-1 herpesvirus Encephalomyocarditis virus Equid herpesvirus 3 Human herpesvirus 2 Human herpesvirus 8 Macacine herpesvirus 1 Macacine herpesvirus 4 Shamonda virus N and NS Shamonda virus RdRp Suid herpesvirus 1 Papiine herpesvirus 2 Ectromelia virus Avian Gallid herpesvirus 3 Psittacid herpesvirus Bacteria Dickeya phage RC-2014 Enterobacteria phage phix174 Mycobacterium phage Astraea Pandoravirus dulcis Pandoravirus salinus Fish Bluegill picornavirus isolate Cyprinid herpesvirus 1 strain NG-J1 Cyprinid herpesvirus 3 Plants Arabis mosaic virus RNA 2 Choristoneura occidentalis granulovirus טבלה 3. זיהוי הנגיפים שקריאותיהם נמצאו בכל שלוש הקבוצות שנבדקו. מתוך 28 מינים שזוהו בכל הדגימות, 15 היו מיונקים, 5 מחיידקים, 3 מדגים, 2 מעופות ו- 2 מצמחים.

13 No. of significant species Single site (G1) hotspots (G2) mosquitos (G3) איור 4. התפלגות הקריאות ממקור נגיפי לפי מאחסנים בכל דגימה. קבוצות המאחסנים הפוטנציאליים נקבעו על פי מין הנגיף. בניתוח הוכנסו 160 הקריאות הגבוהות ביותר. איור 5. בדיקת חפיפת המינים בין שלוש הדגימות. בניתוח הוכנסו 160 הקריאות הגבוהות ביותר מבחינת מספר קריאות למין לדגימה או מבחינת ה- species genome coverage עבור מין ספציפי. הניתוח בוצע ע"י יצירת דיאגרמת Venn באתר: /webtools/venn

14 בחירת הדגימות להרצת NGS שניה בשנה השניה בתכנית בוצעה הרצה ראשונה של שלוש קבוצות: שתים של יבחושים spp( )Culicoides ואחת של יתושי.Culex בשנה השלישית בוצעה בדיקה לארבע קבוצות נוספות, לפי החלוקה הבאה:.C. Punctatus from Sheep,C. Punctatus from Cows,C. Oxystoma pool,c. Imicola pool כל קבוצה הכילה כ- 50 פרטים. הקבוצות נבחרו בכדי לבחון האם יש הבדלים בין התוכן הנגיפי של מיני יבחושים שונים והאם יש הבדלים בין יבחושים בסביבת בקר לעומת יבחושים בסביבת הצאן. בדיקת איכות ההפקות והכנתן לריצוף בוצעה באותו אופן כפי שנעשה עבור ההרצה הראשונה )בשנת המחקר השניה(: ה- RNA נבדק באמצעות BioAnalyzer ונקבע ערך )RNA integrity number( RIN שעומד בדרישות בדיקות הריצוף. הקריאות שהתקבלו נותחו ע"י BLAST-based CLUSTALX ו- Bowtie כנגד בסיס נתונים נגיפי ניתוח ה"פגיעות" בריצופים משנות המחקר 2 ו- 3 בסה"כ התקבלו קריאות של כ מינים. עבור כל קבוצה בנפרד, התקבלו בין 529 ל- 981 קריאות חיוביות לנגיפים, מתוכן 166 עם 10 או יותר קריאות נפרדות )טבלה 5(. בהשוואה לנתונים משנה 2, נראה כי מספר הקריאות הנגיפיות החיוביות היה נמוך במקצת )652 לעומת 777 בהתאמה( אבל אחוז המינים מעל "hits" 10 היה גבוה במקצת 8.4% לעומת 8.9%, בהתאמה )טבלה 5(. C. Punctatus Cows C. Punctatus sheep C. imicola bet Dagan C. imicola hotspots Mosquito pool C. Imicola pool C. Oxystoma pool Total hits Hits 10 reads per hit Hits 10 / total hits 8.67% 8.35% 8.13% 8.05% 10.11% 9.26% 8.17% טבלה 4. נתוני הקריאות הנגיפיות החיוביות מכל הקבוצות שרוצפו באמצעות "ריצוף עמוק" ניתוח התפלגות ה"פגיעות" הנגיפיות עם מעל ל- 10 קריאות לפי קבוצות מאחסנים וקבוצות דיגום בכדי להפחית את הסיכוי להכנסת קריאות שווא לניתוח, נקבע כי זיהוי של נגיף בדגימה בודדת ייחשב אמין, אם באותה דגימה התקבלו לפחות 10 קריאות )10 )reads עבור מין זה. המקרים בהם היו 10 קריאות נגיפיות או יותר עבור אותו מין באותה דגימה נותחו לפי קבוצות מאחסנים )טבלה 4(. בסה"כ זוהו 166 מיני נגיפים עם 10 קריאות או יותר בקבוצה בודדת. בכל קבוצה זוהו בין 129 ל- 147 מיני נגיפים שונים שעמדו בקריטריון זה. ה"פגיעות" הרבות ביותר התקבלו עבור נגיפים שהמאחסן שלהם הוא יונק )38(, חיידק )34( ופרוקי רגליים )31(. בקבוצה בודדת זוהו סה"כ בין 38 )יתושים( ל- pool( 92.C( imicola מיני נגיפים שונים בקריטריון שהוגדר )טבלה 4(.

15 13 imicola bet Dagan imicola hotspots mosquitos Imicola pool 2 Oxystoma Punctatus Cows Punctatus sheep Total hits Algae Amoeba Amphibian Arthropods Avian Bacteria Fish Fungi Invertebrate Mammalian Plants Reptiles Unknown Yeast Total טבלה 5. פירוט מיני הנגיפים, על פי קבוצות הדיגום קריאות )read( בקבוצה אחת לפחות. ועל פי המאחסן שלהם, אשר התקבלו עבורם לפחות בחינת התפלגות המינים שזוהו במאחסנים פוטנציאליים בעלי חשיבות ווטרינרית הראתה, כי אע"פ שזוהו כמעט 80 מיני נגיפים שלמאחסנים שלהם עשויה להיות חשיבות ווטרינרית, סינון הקריאות לפי הקריטריון של 10 קריאות ומעלה, הוריד משמעותית את המספר ל- 28 )טבלה 6(. יתרה מזאת, למרות שהחרקים נלכדו בסביבת רפתות, מספר הקריאות שזוהו כשייכות לנגיפי בקר היה נמוך משמעותית מנגיפי עופות ודגים. נגיף הצאן היחיד שזוהה עם מספר קריאות רב היה Shamonda virus )טבלה 6(. Host Total hits Hits 10 reads Bovine 23 2 Ovine 4 1 Equine 14 3 Porcine 18 2 Avian 8 8 Fish Total טבלה 6. מספר מיני נגיפים שזוהו אשר למאחסנים שלהם חשיבות ווטרינרית. הטבלה כוללת נגיפי בקר, צאן, חזירים, סוסים, עופות ודגים. בעמודה הימנית מופיע מספר המינים מכל קבוצה שעבור כל אחד מהם התקבלו 10 "קריאות" או יותר בקבוצת דיגום בודדת.

16 ניתוח חפיפת התוכן הנגיפי בין יתושים ויבחושים בחינת ההבדלים בין הנגיפים שהחומר הגנטי שלהם זוהה ביתושים לעומת אלו שזוהו ביבחושים, העלתה שמתוך 166 המינים שהיו להם 10 או יותר "קריאות" בקבוצה בודדת, 38 מינים הופיעו ביתושים וגם ביבחושים, ו- 128 זוהו ביבחושים בלבד. באופן מפתיע, לא זוהה אף נגיף ייחודי לקבוצת היתושים כל המינים שזוהו ביתושים זוהו גם ביבחושים. לעומת זאת, מרבית המינים שזוהו ביבחושים )128 מתוך 166( היו ייחודיים להם )איור 6(. Culicoides איור 6. חפיפה בין מיני הנגיפים שהחומר הגנטי שלהם זוהה בקבוצות היבחושים וקבוצת היתושים. לאחר סינון המינים שזוהו בפחות מ- 10 קריאות )reads( לדגימה בודדת, בוצע ניתוח באמצעות יצירת תרשים Venn לבדיקת החפיפה בין הקבוצות. בהשוואת המינים שה- RNA שלהם זוהה בארבע קבוצות שונות של יבחושים.C.C imicola,.c oxystoma, punctatus trapped ו-.C, punctatus naive נמצא כי מרבית המינים שזוהו 111, נמצאו בכל הקבוצות. בשלושה מאחסנים נמצאו 13 מינים משותפים, ובין מין 1 ל- 5 נמצאו בקבוצה אחת בלבד )איור 7(. מתוך מינים אלה שזוהו, סך כל המינים עם 10 קריאות או יותר, שזוהו בכל קבוצה, מפורטים בטבלה 4. באופן מפתיע, בדיקה זו הראתה כי מספר המינים בקבוצת Culicoides punctatus נאיביים, שנבדקו מיד לאחר שהגיחו מחומר שנאסף בסביבת דיר כבשים, היה גדול מזה שזוהה בקבוצה שנלכדה בסביבת רפת חלב 79 לעומת 60, בהתאמה. מספר המינים שזוהה בקבוצת.C oxystoma היה 55, ואילו בקבוצת.C imocola זוהו 92 מינים שעמדו בקריטריון מספר הקריאות )טבלה 5(. מתוך המינים שזוהו, כעשרה עד 15 מינים עשויים להיות בעלי חשיבות וטרינרית, ואלו הם:,Equid herpes 3,Bovine herpes 5,Bovine herpes 1,Simbu group virus,encephalomyocarditis virus,fowl adenovirus,swinepox virus,suid herpes 1,Porcine parvovirus 5,Ovine herpes 2,Equid herpes 5.Ectromelia (mouse pox),tick-borne encephalitis,gallid herpesvirus

17 15 Punctatus cows איור 7. תרשים Venn לבדיקת החפיפה במיני הנגיפים שזוהו בקבוצות מיני יבחושים שונות. מיני הנגיפים שזוהו ב- 10 קריאות לפחות, בקבוצה אחת לפחות, מוינו לפי קבוצות היבחושים בהן הם זוהו. רשימת המינים שזוהו בכל קבוצת יבחושים הושוותה לשלוש הקבוצות האחרות ונוצר תרשים Venn על פי החפיפה בין הקבוצות. Group C. imicola C. oxystoma C. puncatatus trapped C. punctatus naïve No. of species טבלה 4. מספר מיני הנגיפים שזוהו עם 10 קריאות או יותר, בכל קבוצת יבחושים שרוצפה אימות תוצאות הריצוף העמוק באמצעות PCR בכדי לאמת את תוצאות הריצוף העמוק, בוצע ניסיון לזהות באמצעות PCR מיני נגיפים עם מספר קריאות גבוה בחלק או בכל הקבוצות שרוצפו. בדיקת נוכחות נגיף מקבוצת נגיפי Simbu באמצעות PCR הראתה כי אכן ה- RNA הנגיפי נמצא בדגימות שרוצפו, ובדיקה פילוגנטית למקטע שרוצף הראתה כי מדובר בנגיף Shuni )איור 8(. ניסיונות לריצוף הנגיפים Bovine Herpes 5,Encephalomyocarditis virus ו- Macacine Herpes 1 נכשלו.

18 16 Shuni KP Shuni KP Shuni KP Shuni KP PCR from C. imicola pool Shuni KF extraction Shuni KU extraction Shuni HE extraction Aino HE extraction Schmallenberg KX extraction Shamonda HE extraction Shamonda NC extraction 0.05 איור 8. אימות זיהוי נגיף מקבוצת Simbu באמצעות.PCR ניתוח פילוגנטי למקטע שנוצר ב- PCR בו נעשה שימוש ב- RNA מקבוצה 4 imicola.c הראה כי הנגיף ממין,Shuni השייך לקבוצת נגיפי.Simbu הדגימה שרוצפה מוקפת בעיגול אדום.

19 17 5. דיון בעבודה זו בוצעו פיתוח של פרוטוקולים לזיהוי נגיפים בעלי חשיבות ווטרינרית בחרקים וריצוף עמוק לשבע קבוצות של יתושים ויבחושים שנלכדו בסביבת בקר וצאן. המסקנה המרכזית הנובעת מכיול תהליך הבדיקה לנוכחות נגיפים בחרקים היא, שבשל הרקע החזק של חומר גנטי במיצוי מחרקים, כדאי לבצע העשרה מקדימה לחומר הנגיפי - ביצוע פעולות כגון Nested PCR או סילוק ה-,ribosomal RNA על מנת לשפר את הסיכויים לקבל זיהוי רגיש וספציפי עם מינימום רקע. נמצא כי בדיקות שעבדו טוב עם דגימות מבעלי חיים )בעיקר דם( לא בהכרח פעלו טוב כאשר החומר הנבדק הופק מחרקים. מניתוח תוצאות הריצוף העמוק עולה כי ביצוע בדיקה כזו לקבוצות חרקים מעופפים בסביבת הרפת מספק מידע רב שדורש ניתוח מעמיק, וכי נדרש היקף גדול יותר של ריצופים, על מנת לקבל תמונה מלאה של הנגיפים שעשויים להיות בעלי חשיבות הפוטנציאלית למשק. מניתוח מיני הנגיפים שזוהו בבדיקה, עלה כי נגיפי הרפס ונגיף )EMCV( Encephalomyocarditis הופיעו בתדירות הגבוהה ביותר. עם זאת, הניסיונות לקבל אישור לנוכחות נגיפי הרפס ונגיף ה- EMC נכשלו. סיבות אפשריות לכך יכולות לנבוע מהרס הדגימה, מתכנון או ביצוע שגויים של בדיקת ה-,PCR או מפיענוח שגוי של תוצאות הריצוף העמוק, שהצביעו לכאורה על כמות רבה של ה- RNA של נגיפים אלה בדגימות בעוד שבפועל היתה כמות מועטה, אם בכלל. עם זאת, בדיקת ה- PCR לנגיף ה- Simbu אישרה את תוצאת הריצוף העמוק והראתה כי לפחות במקרה הזה, היתה התאמה טובה בין שתי השיטות. מספר תוצאות בניתוח הריצופים הצביעו על כך שנדרש היקף גדול יותר של בדיקות: העובדה שלא זוהו נגיפים ייחודיים ליתושים, והעובדה שזוהה מספר רב יותר של מיני נגיפים בקבוצת המין Culicoides puncatatus הנאיבית, בהשוואה לפרטים שנלכדו בשלב הבוגר בסביבת הרפת. במקרה הראשון, הנחת העבודה היתה שיזוהו מינים ספציפיים ליתושים, ולא כך היה. במקרה השני, הזיהוי של נגיפי הרפס ונגיפי צמחים ביבחושים שבקעו במעבדה ולא נחשפו כבוגרים למאחסנים של נגיפים אלה, יחד עם כישלון זיהוי הנגיפים שזוהו בכמות הרבה ביותר בעזרת,PCR מצריך בדיקה נוספת של תהליך פיענוח הריצוף, בכדי לשלול אפשרות של פיענוח שגוי. מניתוח זה עולה כי נדרש מחקר המשך שיתמקד בשיפור הכנת הדגימות לריצוף נוסף, ובשיפור תהליך ניתוח הרצפים, בכדי להקטין את הסיכוי לפיענוח שגוי. בדיקות של מינים שיזוהו ויעברו אימות, בדומה לנגיף ה- Shuni ונגיף קדחת שלושת הימים יוכנסו לשגרת האבחון במכון הווטרינרי.

20 18 6. רשימת ספרות Amitai Z, Bromberg M, Bernstein M, Raveh D, Keysary A, David D, Pitlik S, Swerdlow D, Massung R, Rzotkiewicz S, Halutz O, Shohat T A large Q fever outbreak in an urban school in central Israel. Clin Infect Dis Jun 1;50(11): Brenner J, Oura C, Asis I, Maan S, Elad D, Maan N, Friedgut O, Nomikou K, Rotenberg D, Bumbarov V, Mertens P, Yadin H, Batten C. Multiple serotypes of bluetongue virus in sheep and cattle, Israel. Emerg Infect Dis Dec;16(12): Davidson I, Braverman Y.Insect contribution to horizontal transmission of Reticuloendotheliosis virus. J Med Entomol Mar;42(2): Elad D. An unholy disease in the Holy Land: The history of anthrax between the Jordan River and the Mediterranean Sea ( ). Vet J Sep 6. Erster O, Roth A, Wolkomirsky R, Leibovich B, Shkap V. Comparative analysis of mitochondrial markers from four species of Rhipicephalus (Acari: Ixodidae). Vet Parasitol. 17 Sep Menasherow S, Rubinstein-Giuni M, Kovtunenko A, Eyngor Y, Fridgut O, Rotenberg D, Khinich Y, Stram Y Development of an assay to differentiate between virulent and vaccine strains of lumpy skin disease virus (LSDV). J Virol Methods Apr;199: Stram Y, Kuznetzova L, Friedgut O, Gelman B, Yadin H, Rubinstein-Guini M. The use of lumpy skin disease virus genome termini for detection and phylogenetic analysis. J Virol Methods Aug;151(2):225-9 Yadin H, Brenner J, Bumbrov V, Oved Z, Stram Y, Klement E, Perl S, Anthony S, Maan S, Batten C, Mertens PPC. Epizootic aemorrhagic disease virus type 7 infection in cattle in Israel. Vet Rec Jan 12;162(2):53-6.