77 מחקרים בלאוקמיה של יונקים הנגרמת על ידי נגיפים חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה סאת חיים גינזבורג הוגש לסינט האוניברסיטה העברית ביום כהי באדר

תמליל

1 77 מחקרים בלאוקמיה של יונקים הנגרמת על ידי נגיפים חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה סאת חיים גינזבורג הוגש לסינט האוניברסיטה העברית ביום כהי באדר א תל כ ב

2 מחקרים בלאוקמיה של יונקים הנגרמת על לדי נגיפים חיבור לשם קבלת תואר דוקטור לפילוסופיה מאת חיים גינזבורג הוגש לםלנט האוניברסיטה העברית ביום כה באדר א תשכ

3 מס מערכת NO. SYSTEM to M L - 1

4 עבודה זו נעשתה במעבדה לוירולוגיה וגנטיקה של מכון וויצמן למדע, בהדרכתו של פדופ ל. זקם.

5 ברצוני להודות לפרופ ל. זקם על הםיוע הרב שנתן לעבודה זו, הדרכתו, עזרתו, הערותיו העניניות והעמדת כל האמצעים שעמדו לרשותו אפשרו את ביצועה של עבודה זו, חב אני רבות לםגל העובדים במעבדות לוירולוגיה וגנטיקה של מכון וויצמן, איש איש בתפקידו, על עזרתם רבת הערך ועל יחםם הנאה.

6 ת_ו_כ_ 2 ה_ע_נ_ 2 _נ_ 2 _ם מבוא כללי חלק א גידול ממושך בתרבית רקמה של תאים לארקמי י ם מעכברים שהושרה בהם לאוקמיה ע י הנגיף MOLONEI (נליימ) או ע י קרני- x של מבוא 7 חומרים ושיטות 8 ניסויים ותוצאות: 1. ביםום תאים לאוקמיים המתרבים למשך זמן בלתי מוגבל בתרביות רקמה התנהגותם של התרביות בזמן ביסוסם של הקווים הלאוקמיים תכונותיהן של תרביות הקווים הלאוקמיים הרובד המזין 16.5 גידולהתאיםבלירובדמזין מראה התאים הלאוקמיים מתרביות הרקמה שתילת התאים הלאוקמיים מתרביות רקמה בעכברים 18 דיון 20 חלק ב השראת לאוקמיה בעכברים ע י נגיף הלאוקמיה של MOLONEI מתרביות התאים הלאוקמיים וכן תרביות קצרות מועד; וניסויים לאתר נגיף לאוקמוגני בתרביות של התאים הלאוקמיים שהושרו ע י קרני-\ מבוא 22 חומרים ושיטות 23

7 ניסויים ותוצאות: 1. ייצור הנגיף בתרביות הקווים הלאוקמיים ייצור הנגיף (א) עייי תרביות של תאים מעכברים לאוקמיים אלא דק שהתאים הלאוקמיים בתרבית התנוונו, (ב) אחרי הדבקת דוברים מזינים של תאי טחול ייצור הנגיף עיי י תרביות של תאי טחול וטימום, קצרות מועד, מעכברים שהוזרקו בנליימ, עם או בלי סימנים ברורים של לאוקמיה השפעת מיהולים וחימום ב העברת הנגיף בתרביות של תאי עובר וכליה השראת לאוקמיה ע י תמצית חופשית מתאים של איברים לאוקמיים, נוזל אסציטי ועייי פלםמה של עכברים לאוקמיים השראת לאוקמיה עייי נליימ בזכרים ונקבות נםיון לאתר פעילות לאוקמנית בתרביות של קווי התאים ה לאו קמי י ם שהושרו ע יי י קדני-א 39 ד י ו ן 44 חל _ג M O L O N E Y לצאצאים העברת נגיף הלאוקמיה של על ידי הורים אמיתיים וחורגים 47 מ ב ו א 48 חומרים ושיטות ניסויים ותוצאות: 1. התפתחות לאוקמיה בצאצאי Fj, של הורים שהודבקו בנליים התפתחות לאוקמיה בצאצאים מעכברים נורמליים שגודלו גידול חורג על ידי אמהות מוזרקות בנליימ, ולהיפך - צאצאי האמהות המוזרקות ע י האמהות הנורמליות התפתחות הלאוקמיה בצאצאי 2^ ו R של הורים מוזרקים בנליימ התפתחות לאוקמיה בעכברים שהוזרק להם שתן בלתי מסונן של עכברים עם לאוקמיה של נליים ד י ו ן טבלאות 1-6 של חלק גי"

8 חל _י ( היוצרות תרחיפים נקיים של מםטוציטים CELLS) (MAST בתרבית רקמה כתוצאה מדיפרנציאציה של תאים לימפואידים מטימום העכבר מ ב ו א 58 חומרים ושיטות 60 תוצאות: 1. הימים 1-12 של תרבית הסימום; תהליך עמוק של ניוון ושגשוג הבא בעקבותיו תהליך הדיפרנציאציה של המםטובלםטים למסטוציטים צעירים - הופעת החומר המטכרומםי; הימים *.3 המםטוציטים הצעירים המםטוציטים המבוגרים תרביות המםטוציטים המבוגרים; הימים מ- 22 עד לפחות םנכרוניזציה של תהליך הדיפרנציאציה המושבות המםסו גלםטי ו ת תאים אחרים בתרבית הסימום הדבקת תרביות הטימוס בנל מ 72 ד י ו ן 75 * תקציר 82. ספרות 86 תקציר בשפה האנגלית

9 » i ראשי תיבות 0.5% Lctlbumin hydrolyzte in Erle's sline Egle sי medium Buffered phosphte sline ל א = מיי א = מ. ב. ז. = Moloney נ ל" מ (MLV) = נגיף ה לא ו קמי ה של r.p.m. ס.ב ם.ם - סיבובים בדקה = סרו מ סוס

10 - 1 - מבר?ן_כלל 2 המחקר הניסויי במזזלת הלאוקמיה נעשה ברובו הגדול בעכברי מעבדה ובעופות. עוד ב הראו 1) Bng (Eliermn & כי מחלה זו נגרמת בעופות ע י נגיפים. עבודה סבלנית רבה וממושכת נעשתה עד היום בחקר היחס בין הנגיפים והלאוקמיה בעופות (4,3,2), בעוד שנםיונות רבים וממושכים לאתר נגיפים לאוקמיים בעכברים, כדוגמת אלו שבעופות, עלו בתוהו. אי הצלחה זו הביאה עימה את הסברה שהלאוקמיה של העופות אפשר והיא מקרה מיוחד, יוצא דופן, שאין לו כל קשר אמיולוגי למחלת הלאוקמיה ביונקים ובבני אדם (5,4). ברור הדבר שידיעות בסיסיות רבות וחשובות הושגו במשך שנים רבות של מחקר במחלת הלאוקמיה בעכברים. מצויות סקירות נרחבות העוסקות באטיולוגיה, פטולוגיה ו אי פיון. טיפוסי המחלה - התנהגותם ותכונותיהם. סקירות אלו (8,7,6,5) ממצות נושא זה במלואו. כדי לקבל מושג רחב על המצב כיום בחקר הקומפלקס הנג יפי-לאוקמי של העופות, סוב *גי י ן בסקירות של 2) (Berd ושל 3).(Drcel טיפוסים שונים של מחלת הלאוקמיה נפוצים בעכברים. הם מתפתחים ידיעת האטיולוגיה שלהם. וזאת משום אי הנקרא כמקובל, "ספונטני באופן, הגידול הממאיר הנפוץ וזן. הספונטנית שונה בכל זן הלאוקמיה תדירות הלימפואידי המתפתח בעכברים הוא הטיפוס הלימפוציטי או ביותר והנחקר מציאות תאים ממאירים בדם אינו (5). באיברים ה לי מפטי י ם דב יחו ד בטימום (8); אף על פי כן התקבל השם לאוקמיה אחרי לגידול זה אופייני דבר לאוקמיה McDowell (Richter &. למעשה דומה לראשונה ע י 9) שאומץ ללימפוסרקומה של בני אדם ויש המכנים אותה בשם זה או זו לימפוציטית בשם לימפומה. תדירות גבוהה מאוד של לאוקמיה זנים טהורים בעלי יצירת ע י F u r t h A K R ו- McDowell ספונטנית כגון 58C ע י ת זו בהתהוות לאוקמיה למחקר מקיף על המקום שנוטלת התורשה הביא נמוכי-לאוקמיה, לזנים גבהי-לאוקמיה זנים בהכלאות בין בעכברים.

11 - 2 - התדירות משתנה בצאצאים ותלויה בזנים המוכלאים; אך היא משתנה גפ במקרים האינדיבידואליים, אולם לרוב מתקבלת תדירות בינ וניונ (ל). לפי 7) (Lw תדירות הלאוקפיה בצאצאים של הכלאות רציפרוקליות היא שוה בין אם האם היא מזן גבה לאוקמיה ובין אם היא מזן נ מו ך-לא וקמי ה. מוקדים אוזרים (6,10) הראו שתדירות הלאוקמיה גבוהה רק כאשר האם הייתה מן הזן גבה הלאוקמיה בעוד שהיא הייתה אפםית או נמוכה מאד כאשר היה האב מן הזן גבה הלוקמיה. דבר זה הוסבר כהשפעה של עמידות הנתרמת ע י האם מהזן נמו ך-הלאוקמיה, ובהעדר גורם משפיע כזה בזן נמוך-לאו קמי ה נתון,,תהיה תדירות הלאוקמיה בצאצאים שוד, בהכלאות הרציפרוקליות (10). ניסויים לבדוק עם הגורם הלאוקמי עובר דרך החלב מזן גבוה לזן נמוך בדומה לגורם החלב של 11) r ( B i t t n e הצביעו על העדר גורם כזה באמהות מזנים ג בה י-לאו קמי ה (12). (Fekete(13& שתלו ביצה מופרית מזן C 3 A K R לזן H ולהיפך והראו שהזן גבה-הלאוקמיה שמר על סגולותיו לפתח את הל^וקמיה הלימפוציטית בעוד שהזן נמוך-הלאוקמיה המשיך לשמור על סגולותיו הקודמות (7). מחקרים אלו ורבים אחרים הביאו איפוא להראות ברורות שהתהוות הלאוקמיה הספונטנית מושפעת ותלויה בגורמים גנטיים. בד בבד עם המחקר בלאוקמיה הספונטנית נעשו מחקרים רבים ושיטתיים באפיולוגיה של הלאוקמיה המושרית ע י גורמים חיצוניים כימיים ופיזיקליים. גם לאוקמיות מושרות אלו הן לדוב מהטיפוס הלימפוציטי. 4 קבוצות שונות של גורמים חיצוניים ידועות במשרות לאוקמיה לימפוציטית בעכברים והן: (1) קרינה מייננת (15,14) ) g ( i o n i z i n. פחמימנים מסרטנים crbonjr) (crcinogenic hydro וחומרים אחרים (16) כגון: עטרן,(methylcholnthren(17.,(16) (2) וזה מ ק ר ו ב י 1 ם, ( i m 18) thyl-1,2- enz«nthrcene#-9,10 e.(urethn(19 (3) אסטרוגנים.(21,20) ולאחרונה (4) נגיפים (26,25,24,23,22). 15) Mixer (Kirschbum & הראו שזנים בעלי תד יד ות נמו כה או כמעט

12 - 3 - אפסית של לאוקמיה ספונטנית יכולים להיות רגישים ביותר ללאוקמיה המושרית ע י גורמים חיצוניים. אופי הרגישות או העמידות לאיזה גורם חיזוני ספציפי נמצא מותנה בהרכב הגנטי של כל זן וזן, ואינה תלויה בנסיה של זן נתון לפתח לאוקמיה ספונטנית (6). הגורמים החיצוניים הללו פועלים דרך איזה מכניזם משותף מאחר ופעולתם היא םינארגיםטית (28,27). הנקודות החשובות הנוספות שהושגו בחקר מכניזם התהוות הלאוקמיה ה ן כדלקמן: 1) הטימום הוא מקום ההווצרות של הלאוקמיה הלימפוציטית (29). 2) הסימום אינו מוכרח לספק את התאים העוברים את השינוי הנאופלםטי,30).(31 3) פעולת ההשראה של הקרינה על התאים העוברים את השינוי הנאופלםסי נעשית באיזה מכניזם בלתי ישיר ואין צורך בקרינה ישירה על תאים אלו (32). 4) מניעת הלאוקמיה ע י קרינה יכולה להעשות ע י הגנת הירך (ומח העצמות בו) בפני הקרינה או ע י הזרקת תרחיף תאי מח עצמות נורמליים לאחר הקרנת כל הגוף. יש איפוא להקרין את כל הגוף כדי לגרום לשעור גבוה של לאוקמיות (33,35,34). ב חל מיפנה גדול בחקר הלאוקמיה עם פרסום ניסוייו של Gross (22). גרום הצליח להראות פעילות לאוקמוגנית בתםנינימ שהוכנו מרקמות לאוקמיות מעכברים מזן AKR בעלי שעור גבוה של לאוקמיה ספונטנית. שתי סיבות הביאו להצלחתו של גרום להראות על נוכחות נגיפים לאוקמיים. הסיבה הראשונה הייתה בחירת הזן המתאים C3H בעל תדירות לאוקמית נמוכה אך מגיב חיובית להזרקת הנגיף, והסיבה השניה ביצוע ההזרקות לוולדות בני פחות מ- 16 שעות. התוצאה הזו אושרה לאחר מכן ע י אחרים (38,37,36). ע י העברות (&סג ) חוזרות של הנגיף בעכברים הצליח גרוס להגביר את פעילותו של הנגיף. בהתחלה הייתה התדירות נמוכה (28$) והתקופה הלםנטית ארוכה (מ- 6 חודשים עד שנתיים) אולם במשך ההעברות הלכה תדירות הלאוקמיה וגברה עד ליותר מ 95$ בזמן לטנטי ממוצע של 3 חודשים (39).

13 _ 4 - מאוחר יותר הראו גרום ואחדים "A."Pssge להעברות פעילות אלו.קרא גרום שהנגיף יכול לגרום ללאוקמיות אף אם יוזרק לעכברים מבוגרים (גיל חודשיים) וכן גם לזנים אחרים ואף לחולדות ( 38,4 ) מאז פרסומו של גרום בודדו נגיפים לאוקמיים נוספים, 23) i ( G r f f -24) scites (Friend, Ehrlich בודדה בודד נגיף הגורם כלורולאוקמיה מתאי מאותם תאים נגיף הגורם ללאוקמיה מטיפוס מיוחד בה מעורבים תאים בטחול ובמח העצמות, הנגיף הזה ספציפי אך ורק לעכברים מזן DBA/2 ו- Swiss ופועל על עכברים מבוגרים תוך זמן לטנטי קצר מאוד (3 שבועות). נגיפים לאוקמיים בודד י Swiss עם לאוקמיה ספונטנית; ולבסוף ם *"י 25) l (Schoolmn et מעכבר ג ם ע,, י 26) (Moloney מםרקומה 37. הנגיף האחרון, זה של Moloney נמצא פעיל מאוד על זנים רבים של עכברים צעירים ומבוגרים וכן גורם ללאוקמיה בחולדות (40). יש לציין שגרוס גילה בנוסף לנגיף הלאוקמי באותם תכשירים, גם נגיף הגורם לגידולים שונים אך בעיקר לגידולים של בלוטות הרוק. מאוחר יותר בודד הנגיף הזה, שכונה בשם polyom ע י העברתו בתרבית רקמה (41). ב הודיעו 42) Kpln (Liebermnn & וכן גדום (43) באופן בלתי תלוי כי הם הצליחו לקבל פעילות לאוקמוגנית-נג י פי ת בתמציות (אקס- טרקטים) של איברים של עכברים לאוקמיים שהושרו ע י קרני-א. המחלה שנוצרה (גרום בעכברים מזן C3H וליברמן וקפלן בעכברים מזן ( C57BL/K הייתה זהה מבחינה פתולוגית מורפולוגית למחלה המקורית שנוצרה ע י הקרינה המייננת, תדירות הלאוקמיה הייתה בתחילה 11$ אצל גרום ו 19$ אצל קפלן אולם ע י העברות גדלה התדירות באופן ניכר, תוצאות אל.ו מעוררות את המחשבה שמא הקרינה גורמת לאקטיבציה של נגיף לאוקמי באיזה דרך שהיא ומסייעת להתרבותו, הנגיף הוא שיפעל על התאים הרגישים ויגרום לשינוי הלאוקמי (44), דבר זה נמצא בהתאם למכניזם הלאוקמוגני הבלתי ישיר של הקרינה המייננת. כל התוצאות הללו, מעוררות אותנו כיום לחשוד שיתכן ואף במחלת הלאוקמיה בבן אדם קיימת אטיולוגיה נגיפית. ברור הדבר היטב שכדי לקדם את המחקר, העומד בפני מכלול רב של בעיות, ביחס בין הנגיפים למחלת הלאוקמיה, יש צורך לחפש ולמצוא שיטות מתאימות שאפשר יהיה בעזרתן לאתר ולזהות את

14 - 5 - הנגיפים הלאוקמיים, לכייל אותם (טטרציה) ולבדוק את הספציפיות האנטיגנית שלהם. כדוגמה טובה לכך יכול לשמש נגיף הפוליומה, שכן פיתוח שיטות מדידה כמותיות 45) vitro ( i n הביא ללימוד נמרץ של יחסי הגומלין בין נגיפים מעוררי סרטן לתאים החיים (48,47,46), אפשר ומנגנון תרביות הרקמה יקדם אותנו הרבה בהגשמת צרכים אלו. דבר ראשוני הכרחי הוא איפוא ללמוד את התנהגותם של הנגיפים הלאוקמיים של העכברים בתרביות הרקמה. טבע התנהגותם בתרבית והתועלת שעלולה לצמוח מכך תלויה, בין היתר, בסגולותיהם של הנגיפים הללו. בהתבסס על הידוע ל 3 ו מהנגיפים הלאוקמיים של העופות והעכברים (4) יתכן והנגיפים הלאוקםיים המשוערים בבן האדם עלולים גם הם להיות ספציפיים מאוד בפעולתם הלאוקמוגנית. אפשרות זו אך מדגישה את הצורך לחפש בתרביות הרקמה דרכים טובות לחקר הנגיפים הללו אין אנו יודעים אלא מעט על תכונותיו ותפקידיו של הסימום והדרך בה הוא נוטל מקום מרכזי בהתהוות הלאוקמיה יתר על כן, טבע הדיפרנציאציה הנורמלית של תאי הדם של בעלי החיים אינו נהיר לנו. כל נםיון להתקרב להבנתם של תהליכי הממאירות לא יוכל להעשות אלא אם כן יובנו היטב התהליכים הנורמליים של התהוות תאי הדם; וכן המנגנונים השומרים על התאים ל השאר נורמליים". עבודתי עוסקת בלימוד התנהגותו של נגיף לאוקמי של מכרסמים in vitro בתרביות רקמה וכץ» in vivo היא מורכבת מ 4 חלקים: חלק ראשון עוסק בגידול התאים הלאוקמיים מעכברים שהושרה בהם המחלה ע י נ גיף- הלאוקמיה; וכן אלו מעכברים שהושרה בהם המחלה ע י קרני א. תתואר שימה נוחה יחםית לבסס ולתמוך בתאים הלאוקמיים בתרבית לאורך זמן בלתי מוגבל, חלק שני עוסק בתכונות הלאוקמוגניות של תרביות התאים הלאוקמיים וכן תרביות אחרות. חלק שלישי יעסוק בלימוד דרכי ההדבקה הטבעית trnsmission) (nturl של נגיף הלאוקמיה מהורים (אמיתיים וחורגים) לצאצאים. חלק רביעי עוםק בניסויים שתוכננו כדי לחקור אפשרויות של השפעה

15 כל שהיא של הנגיף על תאי הסימום ותרניות רקמה. תכונות תרביות הסימום ודרכי הדי 9 רנציאציה של תאיו, שכתוצאה מהן הו 9 יעו כמויות גדולות של מםםוציםים cells) (mst יתוארו גם כן.

16 חלק ראשון גידול ממושך בתרבית רקמה של תאים לאוקמיים מעכברים שהושרה בהם לאוקמיה ע י הנגיף של MOLONEY או ע י קרני-א

17 מ ב ו א ידוע היטב הקושי הרב לגדל תאים לאוקמיים בתרבית רקמה. אם שמים תאים לאוקמיים בתרבית בשיטות המקובלות כיום לגידול תאים in vitro הרי הם מתנוונים לחלוטין כעבור זמן קצר. ואמנם אך מקרים בודדים של גידול תאים לאוקמיים בתרבית לזמן בלתי מוגבל ידועים כיום. (EtLchel(49 ו 50) l (DeBruyn et הצליחו לגדל בתרבית קווים ) (lines של תאים לאוקםיים שהועברו שנים רבות בעכברים נוכחות תאים פיברובלםטיים בתרבית הייתה הכרחית כדי להחזיק את התאים הלאוקמיים. זה מקרוב מסרו & Brook 51) (Osgood על גידול של כמה טיפוסים של תאי^ים לאוקמיים של בני אדם שאי אפשר היה לגדלם קודם לכן, ע י שימוש בקווים מבוססים כבר, כרובד מזין (52). שני מקרים של גידול קווים של תאים לאוקמיים בתרבית ללא רובד מזין, אחד לימפוציטי והשני מםטוציטי שהועברו בעכברים זמן רב, נמסר ע י 53).(Fischer הוא מצא כי צריך להעשיר את מדיום ) (medium התרבית ברמה גבוהה של חומצה פולית וכן פפטון; אך הוא ציין את ההבדלים המוחשיים בדרישות התזונתיות של הקווים השונים של התאים הלאוקמיים - מכאן בא גם הקושי לבםםם בתרביות הרקמה. בעופות גידלו 54) l (Beudreu et במשך זמן בלתי מוגבל תרביות של מילובלםטים ) (myeloblsts לאוקמיים שהושרו ע י נגיף המי לובלםטוזיס של העופות. הם עשו זאת בעזרת מדיום שחוזק בויטמינים מקבוצה ys חומצה פולית ו ג לו קו זה. חלק זה מתאר שיטה פשוטה לבםם ולתמוך בתאים לאוקמיים ע י שימוש ברובד מזין של תאים נורמליים של טחול העכבר. 6 קווים שונים של תאים י ו לאוקמיים שהושרו ע"י נגיף הלאוקמיה של Moloney (נ ל" מ) ו- 2 קווים ע" י קרני-* בוםםו בשיטה זו. בכל המקרים התאים הועברו ) pssged ( בלי טריפ- מיניזציה. אחרי כשנה בתרבית הרקמה, כאשר נוסו, נמצא שאפשר היה לגדל את התאים הלאוקמיים בתרחיפים ) (suspensions נקיים בלי רובד מזין.

18 חומר^ם^ושנטבפ נגיף הלאוקמיה של Moloney (נל מ) (26) נתקבל מדייר מולוניי ירוה הנגיפים נתקבלו בתכשירים נושאי הסימן י,v,-(-l )-Se28)L(Tv בספטמבר 1959 והם אקםטרקטים מיובשים וחתומים שהוכנו לפי הונהליי שלי 26) (Moloney מטחו לי ם ו בלוטות לי מפה של עכברים לאוקמייט מזן 3* : : / c תכשירים אלו נפתחו ונמהלו מי 10 בתמיסת מלח בבו&ד זרחן (מ,נ,ז) לשם הזרקתם לעכברימ. 2 _^_השר אr_]jמ _לא ו 2 1 י 1 לאוקמיה הושרה ע י נ ל" מ לאחר שהי זרק מתחת לעור או ייתר ד דלל חבטן 3-12 םמ ק לעכבר י ם בגיל BL57SM,,C A0.05/2 רים מזן B! d B / c הוזרקו בגיל של חודשי בכמות של 0.2 םמ ק לתוך חלל הבטן לשם השראת לא ר קמי ה בקר נ י- x, הוקרנו עכברים מז ז 05731/6 בגיל של 112 י מנות ש> או 7 הסנה רנטגן יחידות מנות של 170 ב- 4 חודשיים עד חודש יחידות המנה ;מנד לשבוע. שתי לו ת ) trnsplnttions ( של תאים לאו קמי י מ נעשו ע"י הזרקה לתוך חלל הבטן של עכברים מבר גרי מ. לכל העכברים הייתה לאוקמיה למפואידית מלבד עכבר אחד עם כלורולאוקמיה וששימש לביסוס הקו - J-10L !1222M^-22E22-.H222Hl-222BZ2^'2I!-22 עכברים הנושאים בגופם לאוקמי ה ראשונית או שתולה ) trnsplnted ( נפתחו בתנאים סטריליים והאיברים שנבחרו כמקור לתאים נלקחו והושמו הזילז*יו פטרי המכילה מ.ב. ז. האיברים נשמרו 3 פעמיה, הועברו לצלהת המכילה י^ד י ו ם ) sediw. תמיסה מזינה) ונקצצו לחתיכות קטנות באמצעות מלקחיים כד שהתאים יכלו להשתחרר למדיום. המדיום עם התאים המור חפי ם ) suspended ( נאסף והועמד לכמה דקות על מנת להשקיע ולסלק את חתיכות הרקמה הגדולות. הםופרנטנט נמהל לפי ריכוז התאים הדרוש בעזרת מדי ו ם נוסף. בד ו ב המקרים

19 תאים בצלחות פטרי בנות מ מ 7 ובכמות של 4-5 םמ ק של מדיום. כל התרביות הוחזקו בצלחות פטרי באינקובטור 0.5 C, זרימה קבועה של + 10$ ועם C C באויר 4 ^_המי 2 ום^_החלפת_םד 2 ום^_והעברות_של_תרב 2 ות_מבוםםבפ אלא אם כץ נאמר אחרת, מדיום התרבית היה זה ש ל 55) (Egle (מ א) 4x בחומצות אמיניות וויטמינים, בתוספת. 2 0 $ םרום סוסזהו המדיום הסטנדרטי. כדי לתמוך בתרביות מאוכלסות ביותר, היה צורך להחליף את המדיום מדי יומיים; וכדי למנוע ניוון תאים הופחת מספר התאים באומו הטיפול. תרביות מאוכלסות פחות אפשר היה להחזיק במצב מניח את הדעת ע י החלפת מדיום פעמיים בשבוע. החלפת המדיום שכללה כאמור, הקטנת אוכלוםית התאים נעשתה ע י םלוק המדיום הישן עם התאים המורחפים להותיר 1-3 טיפוח. המכילות מספיק תאים לשגשוג מחודש. מדיום טרי הוסף מיד. לא היה צורך בטריפטיניזציה כי התאים הלאוקמיימ צפים חופשית במדיום. העברות נעשו ע י רחיף מתרבית ישנה 1 עד, והמכיל 10 6 X2.5-5 תאים, לצלחות פטרי חדשות המכילות רובד מזין של תאי טחול נורמליים. זהירות יתר ננקטה כדי למנוע זהום הדדי של תאים לאוקמיים מתרביות שונות. 5. הכנת_ר ו_בד_מ! 22 _של_טחבל תרחיפים של תאי טחול מעכברים מבוגרים מזן BL576/C הוכנו באותו סמ ק של המדיום 7 - X תאים נזרעו ב הסטנדרטי בצלחות פטרי בנות 50 מ מ, כעבור 5 עד 10 ימים נדבקה כמות אופטימלית של תאים שהתפרשו על הזכוכית. תאים רבים אחרים צפו חופשית במדיום. המדיום עם התאים החופשיים סולק, התרביות נרחצו והוסף להם מדיום טרי. הצלחות היו מוכנות מעתה לשימוש כרובד מזין. עודפים של צלחות כאלו אפשר היה לשמור במשך שבועות רבים ע י החלפת מדיום כל 7 עד 10 ימים כשהן מוכנות כל רגע לשימוש.

20 גרועים בתמיסת מלח היו מתאים מורחפים במדיום או משטחים שנעשו לקבל אם מרחיפים את התאים אחר כך נמצא שמשטחים יפים מאוד אפשר מאוד. המדיום סולק; םירכוז נמוך; כתהליך שגרתי הושקעו התאים ע י סוס. בםרום לערוך את והורחפו שוב בסדום סוס כדי נרחצו פעם אחת בםרום סוס התאים Ky ב- ונצבעו באויר יובשו המשטחים נעשו בשיטה המקובלת, המשטח..Grunwld Giems לבחון את הזריעה כדי לפני בצלחות הפטרי מכסות הושמו זכוכיות בתמיסת מלח הדרוש, נשטפו בזמן הזכוכיות הוצאו לזכוכית. שנדבקים התאים באותה צביעה. במטנול ונצבעו גם כן פיקסציה עברו פזיולוגית,

21 - i 1 נ!םנ!.!ם_נפנ 5 אנפ 12 ניסויים נעשו כדי לבםם קווים לאוקמיים.in vitro התוצאות מסוכמות בטבלה ניסויים נערכו עם תאים מעכברים שהושרתה בהם לאוקמיה ע י נל מ 2-1 ניסויים מעכברים המושרים ע י קרינה. מאחד ובנימויים אלו, אשר 8 מהם הביאו לביסוס מוצלח של קווים לאוקמיים, נכללים תאים ראשוניים או שתולים, זנים שונים של עכברים, הרכבים שונים של מדיום ומספר שונה של תאים נזרעים יש צורך לתאר באופן תמציתי כל ניסוי וניסוי. הפרטים הנוספים נמצאים בטבלה 1. יםsm העכבר לניסוי זה היה מזן מקורם הראשוני של התאים היה מעכבר מזן s m שהושרתה בו לאוקמיה ע י נל מ. התאים נשתלו בעכבר 40 יום לפני זריעתם בתרבית. לחיה זו היו גידולים תת עוריים ובחלל הבטן וכן טחול גדול מאוד. כדי לבסס את.הקו נוסו הרכבים של מדיום כדלקמן: א) 199 עם ויטמינים של הקבוצה 3, חומצה פולית וגלוקוז ל 9 י Beudreu (54 l ( e t בתוספת 50$ םרומ מעכברים נורמליים. ב) 199 כמו ב (א) + 50$ םרום סוס. מ א ) 50$ + ( Egleסר ו ם סוס. בתרביות עם סדום העכבר ארעה התנוונות מוחלטת. התרביות עם הרכבי המדיום האחרים החזיקו מעמד לזמן מה כשהם מכילים בערך מיליון תאים מטיפוסים שונים בכל צלחת. תרביות אלו דמו בתחילה לאלו של תרביות הטחול הנורמלי עד שהתחיל שגשוג פתאומי של תאים לאוקמיים ביום ה- 24 בצלחת אחת מתוך ה- 8 שהוחזקו במ א. התאים מצלחת זו הועברו לצלחות חדשות עם רובד מזין של טחול במ א בתוספת 50$ סדום סוס. כעבור 4 חודשים הועברו התאים למ א בתוספת 20$ םרומ סוס. מקור התאים לקו זה היה עכבר 6/ עם לאוקמיה ראשונית שהושרתהC57BL 0H0M ע י נל מ. לאוקמיה כללית התפתחה 7 חודשים אחרי ההזרקה של הנגיף. בלוטות

22 הלימפה והטחול היו גדולים מאוד הכליות והכבד נגועים מאוד אולם הטימום נזרעו ב ה ר כ ב י מ ד י ו ם כדלקמן: א) 199 כמו נ («) של $ סדום נורמלי של עכבר. ב) 199 כמו ב-(א) + 50$ סדום סופ. ג) 199 כמו ב-(א) עם 0.001$ חומצה ולית + 50$ טרום םו,ם. י) Erle's sline -. lctlbvuin hydrolyste 0.5$ עם 0.001$ חומצה 9 ולית $ 99 טון + 20$ םרומ םום (ריכוזי החומצה הפולית ו 99 טון לפי 53) ((Fischer ה) מ א עם 0.001$ חומצה פולית $ פפטון + 10$ םרומ םום. רק במדיום (ה) ארעה התרבות ואפשר היה לזהות כעבור 10 ימים בכל ששת צלחות הפטדי של מדיום זה, מוקדים יפים של שגשוג של תאים לאוקמיים. ביום העשירי הוחלף מדיום זה במ א הסטנדרטי + 50$ סדום סוס. מאוחר יותר נתמך קו זה ב- 20$ סדום סוס ]/!קו זה מקורו מתאים של 2 עכברים מזן Swiss עם לאוקמיה ראשונית שהושרתה ע י נל מ, 4 חודשים לאחר ההזרקה. בלוטות הלימפה, הסימום, הטחול, הכבד והכליות היו נגועים מאוד. M התאים נלקחו מבלוטות ירוקות גדולות וטחול אדום ענק של עכבר עם 0148 כלורולאוקמיה ראשונית. הכלור ו לאו קמי ה התפתחה 8 חודשים אחרי ההדבקה בנל מ. הסימום היה נורמלי. בניגוד לניסויים האחרים נשארו התרביות כאן מאוכלסות יפה מלכתחילה ולא ארע ניוון מוחשי. תחתית צלחות הפטרי כוסו במהירות בכמות גדולה של תאים גדולים ועגולים. היה צורך להפחית את אוכלוסיית התאים 3 ימים לאחר הזריעה. שגשונ חזק נצפה החל מהיום ה 14. BALB/c לאוקמיה פרימרית של נל מ לאחר ההדבקה. הלאוקמיה הכללית נמצאה בשלב צעיר בהשוואה לעכברים האחרים. הטחול, בלוטות הלימפה והטימרם היו אך מעט מוגדלים. נעשתה שורת מיהולים תאים שנזרעו על רובד של תאי עובר עכבר. 7 lxio 2 כפולת ^ o i x i עד. תאים בצלחות ריקותניוון עמוק אדע בכל 7 2 x l o

23 *4 s ft* M cn. ני cn 03 o גי cn o - ' M CP * ) ft ft" ff» it i i - 3 גז י w _1 * 3 s T u rj Hf + + I I + טן o - ם #י x -» tf 'גי f CJ -A \T M NT CI U ro M O I o * י ro ffi CJ w O ZJ ני-«י - x «י h 1 % : r sr -* CJ V 3 o י* X * t ro X -X -ו 4 o t-» 1-* o o o גי!-* גי Cr) H Sl «*י cn»-> ro M w טן M ro * t cn * l o> - o X - טז X X X X X X X X X- X X M I-* M H» (-» o o o O o o o o o o o O o נא < cn גי גי גי גי גי גי נ 0 גיי ** 3 13 X ro M ro cn X M o NJ cn X o ניי tf 3 M V-J 4 u x tf _» 3 VJ J J 19» u O CJ Cf O -/ 3 זק H _» o " u זזה וב 3 13 <t 3 o CJ tt u o יה זד _* ו r% גי 3 X j גי VJ J ם X f M 3 J -«f st _» X 3 4!3 _# _1 VJ 3 J <# נ» j -I 3 גי א» גז o ם «י «> x x 3 U ני ^ 3 J I ~* -> w 3 o ^ J X X 3 ד * א 3 ם <* x tf 3 CJ» 3 J 3 VJ O 3 o> cn 3 ס 3 d 3 J' H _f o o o u %r x J u 3 -j 3 3 NT W Cf - X תא * 0 י -1 X -J" -» גז o o _# u _J.9 _l 1 ח 3 vt» W -j» Cf! * # מי) Cf J \ H ^> <1> X תי «g «o D -» Cf u I I X s + o ro»-«-» o - (-» O U» 13 ^ O ^ 19 st O J -» >-*»-k o.=1 + o o> K ט -» _» - +»» + ק Cf קי _t x o tf tf tf «tf ti _» י- 3 ~»» 3 -J * #י J j ~* >- 0 vt -j \r \T U _< u -» u W _/ u u י =1-3 o * ZJ -t 13 j" 13 vf 13 vt 3 <t Nf Cf U VJ J u u ro F NT 13 \T J מ _» מ - -j ~> NT CJ 13 0 J' vt CJ J U U י _< tf» ZJ ~* zj י- CJ ^13 J '» -J «_# J" «J 3 -» u J* M > i»» o «o ro ro ro ro ro ro ro ro טז o o o o o o o o o \ 0 -eft >^ X X X X X X X X X 3 s - Cf Cf Cf Cf Cf Cf Cf 3 Cf X o VJ -J u VJ tf CD י k-j - Cf CJ 3 NT x M UI J u W u u "O -»- u o י 0 2* u vj 3 \T 3 H O Cf 3 o גי לם < ON O ro ON cn י - 3 %r x if tf cj u«3 -J 3 י יי Cf X f_ גז -* X 3 -j x Cf tl 3 י X J Cf «\ X X I J גי Cf _f w u vj טז ti ~* j - u X vj I 3» 3 כי u tf ti 3 3 _( <f 3 Cf CJ Cf W X VJ גי -/ tf 3 tl 3 X X / s 3 w NT _f -» _» CJ CJ Cf o cj VJ X גי VJ X «_J -! J # X cj מ 3 \T </ 3 X _1 3 _l u -/ U Cf u גי 3 u ני J vj -< VJ -* t X -vt X 3 w U!3 ro Cf - cj s X vt trj o o Oi w p ג ני גם נם o R vo < < ON ON H o Cf -( cf 3 S X vt *י 3 J 3 J J U U סי»- TJ U u -( w 01 o NO o O cn CO 0) o c CO cn ON Cf 3 O נ מש ON o p o NT u C/l G מ 3 ס tf tf Cf -» u j גי NT NT _» _ u _# -J 1 X <«( tf X M ן 3 3 l 3 NJ' 3 ן V ^ OJ ~ N 1 י o 1 ן» tf o!.( < o j t-» NT t~* Ol O o s x UJ»-» >\ 1 ^ V ן O 3 v! O ז 1 -J ו * H O Cf X X 1 <( J S 3 cf Cf 1 Cf נ=>^ -0 X ני Cf D «ני -( 3 Cf גי o 3 ' J O 13 * w Cf U 3 - M CJ 3 Cf גזי J <( u 3 tf w D ( 3 U u vj * «ז -( X NT u X tf * «J o cj I u OJ

24 ת צלחו ת, אולם 1 עד 4 מרקדים של תאים לאוקמיים לצלחת נמצאו ביום ה- 10 כצלחות שנזרעו ב- 10 א 1 6 וכן ב- 10^ 7 על רובד של תאי עובר עכבר. מאחר ומושבות התאים הללו היו דבוקים לרובד המזין, הודח&ו התאים בעזרת טריפסיץ והועברו לצלחות חדשות עם רובד עובד עכבר חדש או לצלחות ריקות. 2 סוגי ר, ויועברו ת החדשות צמחו יפה* בד 3 מטחו לי מ ייזל 0 של תאי עובר עכבר. כעבור יומיים נ עי? תה העברה ע י מריפםיניזציה. מוקדיה זול שגשוג הובחנו ביום ה- 21 למן הזריעה. RL^O התאים נלקחו מ- 2 עכברים מזן 31/6 ; :. ן ע הב הדור ה- 11 של העברות תאים לאוקמיי מ בעכברים. התאים הללו מקורם בעכבר מזן BL576/C שפיתח לאוקמיה 7 חודשים אחרי המנה האחרונה (4 מנות) של קרני-א. הייתה לו לאוקמיה למפואידית כללית. 14 יום לאחר שתילה של הדור ה- 11 נלקחו תאי הטחול לתרבית הרקמה. בתרביות אלו ארע ניוון מוחלט בצלחות שנזרעו ב- תאים. ניכרו בתחילה כמה מושבות קטנות של תאים לא ו קמי י ם אולם הם עברו פגוציסוזים ע י המקרופגים. שגשוג נאה נ 9$ ה ביום ה- 9 ב- 6 מתוך 8 הצלחות שנזרעו -ixio^ 7 תאים. RLgi קו זה בוטס מעכבר מוקרן שפיתח לאוקמיה לימפואידית כללית 7 חודשים אחר ההקרנה האחרונה (7 מנות). כאן ארע שגשוג מוקדם וניכר בתרביות בנות lxio 7. תאים לעומת אלו של X נםיונות i-.gx.53,m0143 M0L32, M0L29 לא הביאו להתבססות של תאים לא וקםי י ם.in vitro תרביות אלו הוחזקו למשך 25 עד 46 יום והושלכו מאחר וכל התאי ם החופשיים נעלמו בהדר גהK0L. 53 י ו צא מן הכלל הזה מאחר וארעה שם התרבות של ממטוציטים (ראה חלק די*). במשך הימים הראשונים לאחד מזריעה הייתה גדוד כלל תמותת תאים חזקה מאוד. תמותה זו הביאה לניוון מוחלט של התאים הלאוקמיים או, כאשי קו הופיעו אחרי כן מוקדי שגשוג של תאים לאוקמיים 5 לאוקמי התבסס בה צ לחה

25 ששדדו בתרבית אפשר היה לדאות גם כן תאים אחדים, כנראה נורמלים, כמשך תהליך ההתנוונות של התאים הלאוקימיים. רוב התאים היו היםטיוציטים ותאים דמויי פיבדובלםט שנדבקו לזכוכית. בנוסף, היו גם תאים מהמדיה הנדנו* י לוציםית בשלבים שונים של התבגרות, כנראה תאי לםמה, מגקריוציטים,נודמו- בלםטים, ליםפוצימים ותאים אחריום בלתי מזוהים. תאים אלו נשארו בדרך כלל חופשיים במדיום. כאשר התאים הלאוקמיים התנוונו לחלוטין נכנסו התרביות לשלב יציב עם מיליון עד 2 מיליון תאים חופשיים כנראה נורמליים. מספד התאים החופשיים הללו הלכו ופחתו בהדרגה במשך שבועיים עד חודש עקב התבגרות מלווה בניוון ולבסוף שרדו רק התאים הדבוקים לקרקעית הצלחתי; תרביות אלו דמו מאוד לאילו של הטחול הנורמלי. כאשד שדדו תאים לאוקמיים ושגשגו, התקבלה תרבית מאוכלסת בצפיפות רבה של תאים חופשיים התאים הדבוקים, שהופיעו מוקדם, נשארו ושמשו כרובד מזיןM0L. 9 היה יוצא דופן בזה שהשגשוג של התאים הלאוקמיים נצפה רק אחדי 24 ימים לאחר הזריעה ודק בצלחת אחת. בשלבים המוקדמים של השגשוג נמצאו בדרך כלל התאים הלאוקמיים באשכולות קטנים בקרבת תאים גדולים עגולים, ולעיתים תכופיות הם יצרו כעין שושנות סביב תאים אלר. 22 E2*11!-. 222Z ! -.1!12Z12225.*! התאים הלאוקמיים המתרבים לא נדבקים לזכוכית אלא צפים חופשית במדיום. הם נדבקים במידה זעומה לרובד המזין של תאי הטחול אולם הם ידבקו מיד לרובד מזין של תאי עובר העכבר. עם רובד מזין של תאי טחול אפשר היה םוף באופן סדיר 10 7 X3.5 תאים לאוקמיים מכל צלחת בת. מ מ 50 את האוכלוםיה אפשר היה להגדיל עד ל- 10 א 5 7 תאים לזמן קצר אך אוכלוםיה צפופה שכזאמ היה צורך להפת ית שכן צפיפות כזו מביאה לניוון מהיד. לא געשו עדיין עקומות גידול ע>ל הקווים השונים. כדי *ןבל מושג שטחי על קצב ההתרבות של התאים ינ 1 /ו:ו תוצאות ספירה אחת. 2 מיליון תאים נזרעו לצלחות דיקו* (דאה להלן גידול בלי רובד מזין) ולאחד 96 שעות (4 ימים) נ ם 8 ר ו התאים ונתקבלו ממוצעים לצלחת כדלקמן:

26 - 16 MOL26 M0L50 י = 3xL0 = 1.6x10' 'נ 3.3 & 0 M0I48 RL31 = 2.3x10' הד ו_בד_ה 21 ז להעברות שגרתיות הועדף רובד תאי הטחול על זה של תאי עובר העכבר בגלל אי הידבקות התאים. כאשר תאי עובר עכבר שמשו כרובד מזין הרי נדבקו התאים הלאוקםיים אליהם. נוצרו לפיכך איזורים מקומיים שהיו כה מאוכלםים ph עד כי רק התאים בשולי האיזוד נשארו בחיים. הייתה נפילה חזקה של ה- v דבר הקשור גם כן בתמותת התאים. אורך החיים של תרבית כזו הוא קצר מאוד ויש צורך לפיכך לעשות העברות תכופות למדי בדרך בלתי נוחה של הטדיפםיניזציה. עם רובד של תאי טחול, נשמרו התרביות לזמן רב, התלוי כמובן בעוצמת האוכלוםיה של התאים. עם אוכלוםיה של 10 מיליון עד 15 מיליון לצלחת אפשר היה להחזיק תרבית נתונה למשך חודשיים עד שלושה. פיזור דליל מאוד של תאי טחול על קרקע הזכוכית הםפיק להחזיק את התאים במצב טוב ולא היה צורך כלל בהקרנת תאי הרובד. בגלל הכושר הפגוציטוזי של הרובד הזה מתנקה התרבית מתאים מתים ושברי תאים, תכונה זו אינה מאפשרת להחזיק כמות קטנה מאוד של תאים לאוקמיים $ על רובד הטחול מאחר והם עלולים להטרף ע י ההיםטי ו צי טי ם, בשעור הגבוה משעור התרבותם. ג ידו_ל_המא 2 ם_בל 2 _יבבי_ 25 גז בחודשים הראשונים של ההחזקה ניסיתי לגדל את התאים בלי רובד מזין. לזמן קצר אפשר היה להחזיקם והיה אף שגשוג חזק, אולם היה תמיד שעוד גבוה מאוד של תאים םתי.ם צד בצד עם התאים החיים. דבר זה מביא בסופו של דבר יוון שלם, בחודשים האחרונים ניסיתי שוב לגדל את הקווים, 48 26I0M50, רובד מ ז י ן. 3 1 אם הזריעה הראשונה בצלחות הריקות המשיכו כל הקווים להתרבות יפה מאוד עם שעוד נמוך מאוד של תאים מתים. ע י זריעת 2 עד 5 מיליון

27 תאים בהעברה כל 4 ימים והחלפת מדיום מדי יומיים מוחזקים הקווים ללא רובד מזין במצב מצוין זה כבר למעלה מחודשיים והם נקיים לחלוטין מתאי רובד הטחול. ב 2 עד 3 העברות הראשונות נוקו הקווים לחלוטין מתאים זרים. 22J! _3 EJi!ii _ 2 לאב מב 1!_ם 2 מראה_התא י במשטחי גיםזה נראו התאים זהים לאלו הנמצאים בדם ובאיברים הלאוקמיים. יש להם ציטופלסמה צרה או בינונית כחולה^ נקיה ללא גירגור והגרעין גדול עגול או דמוי כליה. הכרומטין סיבי גס ומכיל בדרך כלל 1 או 2 גדעינונימ ולפעמים 3 עד 4. אפשר לראות לפעמים איזור כרומופובי ליד המ גדולים י ו ת ר. 4 8 הגרעינונים בולטים יותר והציטופלםםה רחבה יותר וכן יש איזור כדומו 9 ובי פרינוקליאדי. בדיקת התרביות החיות הראתה הבדלים בתבניות התאים יד שאפשר היה לזהות או לאפיין כל קו וקו. כךב 10-M0L היו לתאים צורה של אגם לאלו של M0I26 ישנה בליטה ציטופלםמית אחת ולאלו של M0L50 היו. 3 l - היו עגולים ללאבליטותlRL30 m התאים החיים של MOL 26,48,50,79 ו- 1&30,31 נצפו בעזרת מיקרו סקופ הפז ו ת. הממברנה הצימופלםמטית בתאי ה לא ו קמי ה המושרית ע"י קרני-א היא חלקה ורגולרית. לעומת זאת ב 26-M0L שנוצר מלאוקמיה שהושרתה ע י נל מ נראו בליטות או תוספות בלתי רגילות. אחת בכל תא היכולות להופיע ב- 2 צורות. הצורה האחת מופיעה בבליטה מחוספסת דמויית זקן בעוד השניה מופיעה בבליטה משוננת פחות או יותר. בתכשיר אחד של M0L26 שנבחר באקראי 30$ של התאים נשאו את הצורה הראשונה, 40$ את השניה ו 30$ היו חסדי תוספות כאלו. תצפיות מוקדמות ב ML0-48 -וב 50L0 לא M הראו תוספות כאלו אולם מאוחר יותר כשנבדקו הקווים האלו שוב ובנוסף גם M0L79 אפשר היה למצוא בשעוד נמוך מאוד של התאים תוספות מסוג זה. מביניהם היה 79L0M העשיר ביותר: בערךבבדיקה.מכלל התאים היו בעלי תוספות 0.5$ אזזת של תאים לאוקמיים שנלקחו ישר מן העכבר לא נמצאו תוספות כאלו. טבע בליטות בלתי רגילות אלו לא ידוע עדיין ודרושה בדיקה בעזרת

28 18 מיקרוסקופ האלקטרונים. עד היום לא חל כל שינוי מורפולוגי בתאים של כל קו וקו והם שומרים על!ורתם כמבראשית ^22^2222^-222^.2.2*12-^2^2-1112^1 הטבע הלאוקםי של התאים ניתן לקביעה ע י שתילתם בחזרה בעכברים (טבלה 2). התוצאות שבטבלה 2 מראות שחמשת הקווים שמקורם בעכברים מזנים טהורים נשתלו בקלות רבה. רק ב- MOKLO היו קשיים. אולם אותם תאים לפני השמתם בתרבית גם הם נשתלו בקושי בעכברים מבוגרים. אם נלקחו עכברים בקלותMOI. M O L 4 8 י, M0I הם מזנים לא טהורים ותאיהם לא נקלטו.»

29 - 19 טבלה 2 התפתחות לאוקמיה בעכברים שהודבקו בתאים מקווי תרביות הרקמה v קי התאי ם הזמן בתרבית (ימים) העכבר ים המודבקי ם גיל העכבר י ם הםודבקי ם!.עודפים! _ מספר התאי ם שה ו זרקו מספר העכברים זמן שמתו מלאוקמיה ממו צ מספד העכברים (ימי המוזר י ם 27 2/2 1 X SWR 24 M0L9 12 5/5 7 X SWR 46 M0L9 חתיכות רקמה 34 3/5 לאוקמית חתיכות רקמה - 0/5 לאוקמית 1.0 C57B1/6 (Do M0L C57BL/6 (Do M0I10-0/2 5.4 X C57BL/6 45 M0L10-0/5 5.4 X SWEt 45 MDHO 36 2/13 5 X C57BI/6 49 MOLLO - 0/5 ; 4 X Swiss < 8 >22 M0I26 (3) 126 < 3 )1/5 3 X SWR (2)22 M0I /2 9 X BALB/c 56 M0L /5 9 X G57BL/6 16 RL /5 5.5 X C57BL/6 160 RL /5 1.6 X C57BL/6 70 RL /5 7.2 X C57BL/6 157 RL31 (1) תאים אלוהעברו מהעכבר הראשוני לעכבר המקבל ללא השמה בתרבית רקמה. (2) קו זה מקורו בתאים של עכברים מזן Swiss בלתי טהור. (3) הלאוקמיה בעכבר זה הושרתה כנראה ע י נגיף.

30 ב_ 2 _ב_ן i מאחר ומטרת העבודה של חלק זה היתה לאפשר שיטה פשוטה לתירבות * vitro in של תאים לאוקמיים של העכברי יש לקחת בחשבון שתי בחינות של צרכי התאים הללו. הבחינה האחת קשורה בתנאים הדרושים לביםום ראשוני של התאים והשניה תמיכת התאים לאורך זמן לאחר שבוססו. הניסויים הנוכחיים הראו שבמשך הימים הראשונים לאחר הזריעה באות התרביות לקראת משבר מלווה בניוון תאים נמרץ. בתרביות שהתגברו על משבר זה הופיעו לאחר מכן מוקדי שגשוג של תאים ששרדו בתרבית. אם הושג שלב משגשג זה, לא היה כל קושי בתמיכת התרביות, שהן בעלות יכולת התרבות גבוהה מאוד, כאשר הן הוחזקו על רובד י מזין של תאי טחול במדיום של Egle מחוזק בסדום םום. מבין 12 ניסויים, 10 עם לאוקמיה מושרית ע י נל מ ו- 2 עם לאוקמיה מושרית ע י קרני-^ ב- 8 התבססו קווים שונים של תאים לאוקמיים, בעוד 4 מהם נסתיימו ללא הצלחה. אף כי אין כל קושי בתמיכת קווי התאים, הדי ישנם גורמים שאי אפשר לצפותם מראש והקובעים את יכולתם של התרביות להתגבר על המשבר ההתחלתי. ניסויים נוספים עם הרכבי מדיום שונים נחוצים לפיכך כדי לאפשר שליטה סדירה הניתנת לכיוון מראש, על המשבר ההתחלתי. מאחר ורובד מזין של תאי עובר העכבר טוב לקלוניזציה (clones) של תאים, לאוקמיים, טיפוסי רובד מזין מסוג כזה יכולים להיות טובים גם כן לבסס ביסוס ראשוני תאים לאוקמיים in.אף vitro כי אין בידינו היכולת לקבוע מראש את הגורמים שעלולים לשלוט בתקופת המשבר, אפשר לראות לפי תוצאות אלו ששימוש ברובד מזין של תאי טחול ומדיום של Egle עם סדום םום מספק מערכה פשוטה כדי לבסס ולתמוך בתאים הלאוקמיימ שהושרו ע י נל מ ועייי קרני-א. הגידול החופשי של התאים במדיום מאפשר לנו הספקה תמידית נוחה של תרחיפי תאים למחקרים כמותיים שונים. היכולת לגדל את התאים ללא רובד מזין מאפשרת לנו לברר שאלות רבות הקשורות ביחסים בין הנגיף לתאים הלאוקמיי ם. אין סיבה לא להניח שמערכת זו יכולה להיות טובה גם כן לתאים

31 לאוקמיים אחרים, כלומר, אלו המושרים עייי נגיפים אחרים, גורמים שונים לאוקמיות ספונטניות, לאוקמיות מסוגים שונים, מזנים וממינים שונים של בעלי החיים וכוי*. שיטה נוחה לגדל תאים לאוקמיים מקבוצות ניסוייות שונות ובעלי ערך אםיולוגי שונה עלולה להיות לעזר רב לקידום המחקרים במחלות הלאוקמיה ובחקר הנגיפים ויחסם ללאוקמיה.

32 חלק שני השראת לארקמיה בעכברים ע י נגיף הלאוקמיה של MOLONEX מתרביות התאים הלאוקמיים וכן תרביות קצרות מועד; וניסויים לאתר נגיף לאוקמוגני בתרביות של התאים הלאוקמיים שהושרו ע י קרני-א

33 מ ב ר א בחלק אי* תוארה השיטה שבעזרתה אפשר היה לגדל את התאים הלאוקמיים למשך זמן בלתי מוגבל. נחוץ יהיה עתה לדעת מה מקומו של הנל מ במערכה זו של תרביות הרקמה וכן מקומו בתרביות אחרות. מאחר והדבקה בנגיף הלאוקמיה לא הביאה לשום שינוי או לאיזו השפעה כל שהיא הנראית לעין על התרביות ותאיהן אין באפשרותנו לבדוק את נוכחות הנגיף בתרביות אלא אם כן (א) נזדיק את נוזלי תרביות הרקמה לעכברים ונצפה להתהוות הלאוקמיה בהם (ב) נבדוק את התרביות המודבקות תחת מיקרוסקופ האלקטרונים. לשתי הדרכים מיגבלות עצומות. חלק זה יתאר את הבדיקות שנעשו בדרך (א). בדיקות אלו מאפשרות לנו לאסוף ידיעות מספר על תכונותיו של הנליימ. ענין מיוחד יש לנו במקדה של השראה לאוקמיה ע י קרינה מייננת מאחר ונמסר (44,43,42) על פעילות לאוקמוגנית של תםנינים של רקמות של עכברים שהוקנו בקרני-א. בדיקות על מנת לגלות פעילות לאוקםוגנית בתרביות התאים הלאוקמיים שהושרו ע י קרני-א יתוארו איפוא במקביל לאילו שנעשו עם הנל מ שבקווי התאים הלאוקמיים.

34 חומר 2 ם_וש 2 טרת עכברים מזן Swiss (זן בלתי טהור) שוםשו לרוב לבדיקות של נליימ מאחר וזה היה הזן היחיד שעמד לרשותנו בכמויות מם 9 יקות. למרות הווריאביליות בתגובתם להדבקה בנליים, רגישים הם בכל זאת כאשר הם מוזרקים בגיל צעיר. עכברים מהזנים 31 1B57C -וBALB/c, 1 / 6 ש ו מ ש ו לניסויים מיוחדים כמתואר להלן. עכברים בגיל 1-7 ימים הוזרקו מתחת לעור או לתוך חלל הבטן בכמות של 0.05 או 0.1 םםייק. העכברים הוחזקו במשך תקופת ההסתכלות כל משפחה בכלוב אחים ואחיות יחדיו. נקבות הורשו להמליט באותו כלוב אולם הוולדות הופרדו מיד מאמותיהם. ברוב רובם של המקרים הוחזקו העכברים לא יותר מאשר כשנה אחת. העכברים ששרדו כעבור שנה נפתחו ונבדקו והממצאים נרשמו. העכברים נבדקו למציאות לאוקמיה וכן ממצאים אחרים פעם או פעמיים בשבוע עייי מישוש בלוטות הלימפה ) inguinls ( והטחול. כמו כן הוסבה תשומת הלב לחולשה כללית וקשיים בנשימה למקרים שבהם מעורב רק הטימום. מאחד ועכברים רבים הומתו ונותחו למטרות שונות, כאשד נמצאו לאוקמיים, נלקח לרישום זמן הופעת הלאוקמיה עייי מישוש ולא זמן המוות כמקובל אצל חוקרים אחרים. העכברים שנמצאו מתים נפתחו ונקבעה בהם ההבחנה. תכשירים היססו- לוגיים נעשו עייי פיקםציה ב Bouin וצביעת החתכים בהמטוקםילין - אאוזין. משמחי דם והדפסים של איברים שונים נעשו גם כן ונצבעו ב- My-Grunwld Giems (להלן גימזה). עכברים שמתו ללא לאוקמיה במשך 2 החודשים הראשונים לאחד ההזרקה הוצאו מחשבון התוצאות. בכל הנםיונות נמצאו 8 עכברים שמתו בזמן העולה על חודשיים וההבחנה שלהם הייתה לא לכאן ולא לכאן. הם הוצאו מחשבון התוצאות. אלא אם כן נאמר אחרת, הלאוקמיה שהתפתחה אחרי ההדבקה.(Dunn בנגיף היתה ליפפואידית כמתואר עייי 56 ) et l 2.תר Hבע_ 5 י 1 E52 התאים הלאוקמיים גודלו כמתואר בחלק אי*. סדום הסום עבר או לא עבר חימום ב למשך חצי שעה לפני השימוש. התאים הלאוקמיים הועבדו

35 לרובד מזין חדש בערך כל שבועיים. תרביות של תאי עכברים נורמליים הוחזקו lctlbumin-hydrolyzte 0 ב- Erle's sline (להלן לי א) עם 10$ או 20$ םרום םום. תרביות של תאי עובר עכבר וכליה נעשו באופן המתואר ע י וינוקור ). 46 (לעריכת תרביות ראשוניות, נזרעו 0 6 xl8 תאים 6 בצלחות פטרי בנות מ מ 100 ; ולתרביות משניות נזרעו lxio תאים בצלחות בנות 50 מ מ. תרביות של תאי כליה נעשו מעכברים בגיל 3-4 שבועות ונזרעו ב- 10*1 6 תאים בצלחת. המדיום הוחלף בדרך כלל פעמיים בשבוע וכל התרביות הוחזקו באינקובטור כמתואר בחלק אי. 2 הכנת_הנב 1 < _ל 2 ם_ להד ב י ל[ת_ה ע כ בר תר ב!]ו_ת_ה רE3 i 3 נוזלי תרביות התאים הלאוקמיים הוכנו בצרופי טיפול שונים שהעיקריים הם כדלקמן: א) המדיום יחד עם התאים הלאוקמיים נאספו ע י בחישה והוקפאו ב , למשך זמן של יום אחד עד 5 חודשים. לפני השימוש הופשר המדיום והתאים ושבריהמ סולקו ע י םירכוז. הםופרנטנט מונן. ב) המדיום יחד עם התאים הלאוקמיים נאספו ע י בחישה; התאים סולקו מיד והםופדנטנט םונן. ג) המדיום יחד עם התאים הלאוקםיים נאספו ע"י בחישה; התאים סולקו והםופרנטנט הוקפא ב למשך יום אחד עד 5 חודשים. אחרי כן הופשר ומונן או לא םונן לפני השימוש. מאחר ובכל הטיפולים השונים נתקבלו שעורים גבוהים של לאוקמיה לא יתואר הטיפול בכל מקרה ומקרה נתון. לאור הניסיון שנרכש, םוגל טיפול מם. 1 להכנת מאגרים stocks) ( של נל מ וכן לשם שימוש שיגרתי, כמקור לנל מ של נוזלים בעלי פעילות לאוקמוגנית גבוהה. בשימושים אלו נמנע בדרך כלל הסינון אם לא היה צורך םביר בכך. הנוזלים םורכזו במהירות של 2500 ם.ב. r.p.m.) ( פעם או פעמיים למשך 15 דקות. פעם ואחרי כן ב למשך דקות. הם מוננו 02Sels^ או.03 טיפולים נוספים יתוארו בחלק הניסויי.

36 נ 2 םר 22 ם_רתרצ? 1 נפ נתונים על השראת לאוקמיה לאחר הזרקת נוזלי תרביות הרקמה מקווי Swiss, (M0I26) Swiss, (MOLLO) C57BL/6, (MOL9) SWR עם התאים מזנים 5 0 ( 1 מוצגים בטבלה ( c. B A L B / נתונים אלו מראים שכל התרביות ייצרו נל מ בזמן הנבדק. הם מראים ששני עכברים פתחו דולאוקמיה לאחר ההזרקה של נוזל היום ה- MOL24 של. 9 אחד מעכברים אלו שימש לביסוס M0I48 אולם אף כלורולאוקמיה לא התפתחה עד היום לאחר ההדבקה בנוזל מM0I אין אנו יודעים אם ייצור הנגיףי במערכת הקווים הלאוקמיימ על רובד מזין של תאי טחול נורמליים הוא דבר קבוע המתרחש כל הזמן. קיימת אפשרות, למשל, שהנגיפים ימשיכו להיווצר בתרבית אולם הם יאבדו את הכושר לגרום ללאוקםיה. אפשר גם שהנגיפים במשך זמן רב בתרבית ישתנו בכיוונים שונים, יופיעו מוטציות חדשות וירכשו תכו נ ו ת-א חדו ת. יתכן והנגיפים יעלמו כליל במשך הזמן מחוסר תנאים מתאימים להם בתרבית או עקב פעילות םינטטית חלשה של חלקיקי נגיף. צריך לבדוק םשיום כך אם התכונה הלאוקמוגנית נשמרת במערכת זו לאורך זמן. בטבלה מוצגות תוצאות בדיקה כזו עם 26MOL2 בכל הדגימות שנבדקו מלבד היום ה- 4, נתקבל שעור גבוה של לאוקמיות. שעור נמוך נתקבל בכל זאת מנוזל היום ה- 4 לאחר הזרקת המשקע שנתקבל עייי םירכוז רב עוגמה. כושר לאוקמוגני רב קיים עדיין אחרי 290 יום בתרבית. ^מ 22 ם_אלא_ר _שהי 22 2_S _ 1 לi22 פא 5._1 י ל מאחר והתאים הלאוקמיים נתמכים בתמידות בנוכחות רובד מזין, יש צורך לנסות ולקבוע איזה הוא החלק שעלולים ליטול תאי הרובד בייצור חלקיקי נל מ. כדי להתקרב פחות או יותר למצב האמיתי והוא: תאים לאוקםיים במגע תמידי עם תאי הרובד המזין, נבדק בשני אופנים ובכמה צירופים. האחד - (א) ע י ניצול תרביות של תאים מעכברים לאוקמיים בהם לא ארע שגשוג של

37 םבלה_ 1 השראת לאוקמיה בעכברים מזן Swiss ע י נל ם שנלקח מתרביות של הקווים השונים של התאים הלאוקמיים. מקור הנגיף משך הזמן עד הזמן מספר העכברים גיל הזמן המתבלות לקבלת להופעת ה לא ו קמי ים העכברים בתרבית (חודשים) 50$ הלאוקמיה מספר העכברים בזמן (ימים) לאוקמיה הראשונה שהוזרקו ההזרקה ( 4 )4/ M0L * / M0L / M0L ( 5 )!2/ M0I / M0I4S ( 6 )15/ M0L50 לפני ההזרקה דרך (0.31 Sels (סונן (2 למשך 30 דקות ב- 0^3 לפני ההזרקה (חומם ב למשך 30 דקות בנוכחות $ היאלורנדזה לפני ההזרקה (3 (חומם 4) 2 5) 2 (עכבר אחד מת במשך תקופת ההסתכלות בלי סימני ל»וקמיה (6

38 ט ב לה 2 השראת לאוקמיה בעכברי Swiss ע" י נל מ שנלקח בזמנים שונים מתרבית הקו M0L26 - Swiss המספר הניסויי הזמן בתרבית (ימים) גיל העכבר י ם בזמן ההזרקה _( 2 מיפ) מספר העכברים ה לאו קמי י ם מספר העכברים שהו זרקו הזמן לה. ו פעת ה לא ו קמי ה הראשונה הזמן עד לקבלת 50$ לאוקמיה 31± בי& י.l משך ההסתכלות (חודשי ם) / (1)26 P / (2)26 E ( 3 )15/ I / M / ,54 A 33 B1 59 F / A / / R / I (1) הנוזל העליון מתרבית של תאים לאוקמיים על רובד מזין של עובר עכבר נט P 26 אחרי הםירכוזים - םורכז עוד הפעם g לשעה אחת. משקע הודחף ב-מ.ב.ז. ריכוז x. 0 5 ה ו ק פ א והופשר (3) 2 עכברים מתו במשך תקופת ההסתכלות בלי סימני לאוקמיה (4) נקבות

39 תאים לאוקםיים ותחת זאת התכםתה קרקעית הצלחת בצפיפות במאים גדולים ועגולים. אפשר להווכח לפי סבלה 3 שכאשר נבדקו תרביות אלו בימיהם ה- 52 וה- 61 נמצאה פעילות לאוקםוגנית. לבדיקה באופן השני - (ב) נעשו 3 ניסויים המוצגים בטבלה 3. בניסוי הראשון הודבקו פעמיים רובדים מזינים של טחול בתערובת של נוזלים מM0L - 9 ימים 4 בהפרש זמן של הנוזל מהרובדים נבדק לפעילות לאוקפוגנית ביום ה- 26 לאחר סינון דרך Sels 02.לא התפתחה שום לאוקמיה. בניסוי השני בה תערובת של נוזלים מM0L - M 0 L 2 6 ו 50 עם תרחיף של תאי טחול לפני הזריעה ו- 8 ימים לאחר מכן הודבקו התרביות בשנית באותה תערובת נוזלית. נוזל תרביות אלו נבדק 22 יום לאחר ההדבקה השניה. נתקבל שעור נמוך יחסית של לאוקמיה. בניסוי השלישי הודבקו הרובדים בנוזל של -2L0M ובניגוד ל 26 הניסויים הקודמים נבדקו תאי הטחול יחד עם המדיום לנוכחות נל מ. ביום ה 27 הוקפאו הצלחות נ,-fc)6 הופשרו, ר^תרחיף שנאסף םורכז פעמיים ב ם.ב. והסופרנטנט חומם למשך דקות ב ft (ראה להלן). בניסוי זה נתקבל שעור גבוה למדי של לאוקמיות (טבלה 3). התוצאות למעלה מראות (1) שתרביות למשך זמן רב רים מזינים של טחולי ( BL57C/62 יכולים לייצר נל מ. בדיקת היכולת של תרביות התאים הלאוקמיים הגדלים ללא רובד מזין לייצר נל מ נעשית עתה והתוצאות תתקבלנה מאוחר יותר. נוסף לבדיקות של ייצור נל מ ע י התרביות ארוכות המועד, נערכה גם בדיקה כדי להשוות ייצור הנגיף ע י תרביות קצרות מועד מעכברים שהודבקו בנליים ושהיו להם סימנים ברורים של לאוקמיה ^תרביות מעכברים שלא היו להם כלל סימנים כאלו. טחול וטימום מ- 3 עכברי Swiss בגיל של 2,5 חודשיםובלי 2 - סימנים ללאוקמיה נזרעו על רובד של תאי עובר עכבר בצלחות פטרי בנות 100 מ מ. העכברים הוזרקו בגיל 3 ימים בנל מ. לשם השוואה נזרעו על אותו רובד מספד

40 טבלה_ 3 2 השר את_לא ו_ מ 2 ה_בעכבר S]Adss _?"ל^מ_ 2 ל _ &E2 ii_ 22 3i3_2222i:D2^ הנגיף מקור הקבוצה הניסויית הזמן בתרבית (ימים) גיל העכברים בזמן ההזרקה (ימים) מספר העכברים הלאוקםיים מספר העכברים שה וזד ו הזמן להו פעת הלאוקמיה הראשונה (חודשי ם) הזמן עד לקבלת 50$ לאוקמיה (חודשי ם) משך ההס תכלות {וודשי ם) A6_ A l 2.8 2_.8 10/13 6/ ( 1 ) ( 9 M0I48 MOL^O X / ( 4 )26 רובד מם. 2)1 ) /13 4 (4)22 ב רובד מם. 2 8 A 8 4 A4, 5 j ן 2 11/15 3 (4)27 רובד מם. 3 ביקורת( ( 3 (2)< 11 0/ הלאוקםיימ. התאים התנוונו (1) תרביות בהן ההזרקה. לפני Sels (2) מונן דרך 02 מתרבית של תאים של טחול נורמלי נוזל (3) האחרונה. ההדבקה בתרבית למן הזמן (4)

41 - 30 לאוקמיים (עכברים אלו שימשו גם כמקור Swiss של תאי טחול וםימום מעכברי נורמליים שלא הוזרקו (26 אי") וכן מעכברי SwissI0Mחלק התאים לביסוס כלל. בדיקת התרביות הצבועות בגימזה הראתה שהתרביות םהעכברים שכפי הנראה היו לאוקמיים אולם מודבקים בנגיף, היו דומות לתרביות שנעשו מעכברי לא הביקורת הבלתי מוזרקים. לעומת זאת רןתאים המצויים ביותר בתרביות של העכברים הלאוקמיים היו במושבות האופייניות לתאים הלאוקמיים. תוצאות הבדיקה בעכברים (טבלה 4) מראות שהתרביות ביום ה 8 מעכברים שהוזרקו בנל מ ושיש להם או אין להם סימני לאוקמיה ברורים הן היו בעלות כושר לאוקמוגני חזק מאד. ה ש פע ת_מ 52 ב ל 2 ם_ו_ח 52 גט_ 5 5_12 דגימות של הנגיף מתרביות התאים נבדקו בםיהולים שונים וכן אחרי. חימום ב למשכי זמן שונים, ע י הזרקות לגורים ולעכברים מבוגרים. בכל הניסויים הללו עבר סדום הסום, ששומש לתירבות התאים, אינאקטיבציה ע י חימום לפשך דקות. בניסוי המיהולימ הראשון (מם. E21) נבחר נוזל היום שלO.0MOI53 שסונן דרך ונשמרבC60 Sels - עד להזרקה. מיהולים עד ל- ~10 4 נבדקו בעכברים מבוגרים זכרים מזן,SWR באופן בלתי צפוי הופיעה, s ם ד ר ה ה ו פ ע ה ב- 3 10, הלאוקםיה הראשונה במיהול של 4 "ס! ו א ח ר י כ ן,v , 4- ו ~10. 4 שום לאוקמיה לא התפתחה בעכברים שהוזרקו בנוזל הבלתי מהול (טבלה 5), אף כי אותו נוזל השרה 9/14 לאוקמיות כאשר נבדק בלתי מהול בגורימ מזן Swiss (טבלה 1). ניסוי שני נעשה עם נוזל של היום ה - 0 שלU0M.20 (ללא סינון) שנשמד ב כאן נתקבלו גם כן לאוקמיות רק ב וב- ""10 3 אך לא ב- "10 2 או 10 ניסוי - 1 מס ). d21 טבלה.(5 בניסוי השלישי נערכה השוואה בין גורים מזן Swiss לבין עכברים מבוגרים מזן BALB/c (גורים מזן זה חסרו במעבדה זו). תרחיף תאים שנאסף חודשים ב 4 נשמר למשך c60 -. הוא הופשר, חומם למשך 30 דקות ב בתוספת 0.001$ היאלורונידזה^ 1 ( וםורכז ב ם.ב.. ^ ^ Bovine testes hyluronidse, Worthington Biochemicl Corp., New Jersey.

42 טבלה_ ll2-l'll--^B-BB B2^, Z-I1^.212 של._תא 2 ם_שנ ליןח^_מעכבר 1222-H Z2L *2.-* * גיל העכבר י ם בזמן הה זרקה (ימים) מספר העכבד י ם הלאוקמיי ם מספר העכבר י ם שהו זרקו הזמן להו פעת הלאוקמיה הראשונה (חודשים) הזמן עד לקבלת 50$ לא ו קמי ה (חודשים י משך ההסתכלות (חודשים ( מקוד הנגיף( ( 1 מספר הניסוי ^12/ / /11 6 ו נוזל היום ה- 8 מתרבית של תאי ם לאוקמי ים על רובד של עובד עכבר (M0I26) י נוזל היום ה 8.מתרבית של תאי טחול וטימום על רובד של עובר עכבר, מעכברים ללא לאוקמיה; חודשים אחרי הזרקתם בנוזל מ 2L M0- בקורת נוזל היום ה- 8 מתרבית של תאי טחול ו טי מום, על ר ו בד עו בד עכבר, מעכבר י ם בלתי מוזר י ם. 26 G 26 H 26 F (1) בשלושת הקבוצות מקור הנגיף היה מדיום עם תאי טחול וטימום על דובד של עובר עכבר; הוקפאו והופשרו פעם אחת; םורכזו ב ם.ב.; המשקע הוקפא והופשר 3 פעמים וםורכז ב ם.ב. 2 הםופרנטנטים צורפו יחד וםורכזו ב ^ (2) עכבר אחד מת במשך תקופת ההסתכלות בלי סימני לאוקמיה.

43 מיהולים של הםופנטנט נעשו במדיום המכיל $ היאלורונידזה והוזרקו מיד לחיות (ניסוי 58 מבלה 5). בעכברים מ ז ז BALB/c (זכרים ונקבות) נתקבל שעור גבוה יותר עם זמן לטנטי קצר יותר במיהולים של 3 10 ו- ~"10 2 מאשר במיהול של "10. 1 השעור הנמוך ביותר נתקבל בנוזל הבלתי מהול. לעומת זאת, אחרי הזרקה לגורים מזן Swiss נתקבל שעור של 100$ לאוקמיות ע י החומר הבלתי מהול וע יי 10, - 1 וירידה בשעור הלאוקמיות ע י המיהולים הגבוהים יותר. התוצאות הללו רומזות על מציאות איזה גורם במדיום הקווים הלאוקמיים היכול להקשות על התפתחות הלאוקםיה כאשר הוא יוזרק לעכברים מבוגרים. גורם זה נחלש או נעלם כאשר נמהל לפני כן הנוזל המוזרק. ניסויים נוספים על השפעת מוהלים שונים וכן חימום ב לתקופות וזל היום ה - 0 M של. 2 6 L 5 2 המדיום הזה עם התאים הלאוקמיים םורכז בי ם.ב., םונן דרך,Sels 03 פוזר במבחנות ואוחםן ב 6(?c-. לשם הזרקת מיהולים ונוזלים מחוממים לגורים, הופשר הנוזל, בערכו המיהולים שהוקפאו שנית. החלק שנועד לחימום פוזר במבחנות והוקפא גם כן. כאשר עמדו גורים לרשות הניסוי, הופשר המיהול המתאים או המבחנה שחוממה כדרוש לפני ההזרקה. עכברים מבוגרים הוזרקו באותם המיהולים והחימומים ביום ההפשרה ללא הקפאה נוספת. התוצאות ניתנות בטבלה 6. כאשר נמהל נוזל זה^ ביום השני לאחר ההקפאה, ב מ.ב.ז. והוזרק לעכברי Swiss (ניםוי 8 33), נתקבלה רק לאוקמיה אחת במיהול 2 10 ואף לאוקמיה במיהולים הגבוהים יותר. כאשר נבדק אותו נוזל כעבור 5 חודשים ולאחר שנמהל ב מ א עם 20$ סדום סוס (ניסוי 54) נתקבלו 6/14 לאוקמיות במיהול של 4 " 10. אותו המיהול ב-מ.ב.ז. נבדק גם ב BALB/c מבוגרים (ניסוי 33 עקומה מם. 1). כבניםויים האחרים גם כאן השראת לאוקמיה טובה יותר נתקבלה במיהול של ~10 2 לעומת הנוזל הבלתי מהול. ;חימום ב- c? 3 נעשה כדי לבדוק את יציבותו של הנל מ בטמפרטורה זו. הדבקת עכברי BALB/C מבוגרי ם (ניסוי 33, c ע ק ו מ ה מם. 2) בנוזל בלתי מהול מחומם למשך חצי שעה הביא לשעור גבוה יותר של לאוקמיות וכן הופעתן של הלאוקמיות היו מוקדמות יותר בהשוואה לנוזל הבלתי מהול ובלתי מחומם. תוצאות אלו רומזות שהגורם המפריע להשראת הלאוקמיה בעכברים מבוגרים עלול להחלש

44 גי -* x <» * M* U tf -» J' u tl «< ti 1 I <3 O U M Cf x u CD h w o Offl ft* IlK H» M K cn cn 1» o> o» o» OJ OJ < 1 מ I! H cn I I I OJ GJ OJ I to,f. 0> t-* -יי גם o ti* ro\o> b 00 o> o si I I I I I to *> «M w o to to OJ it*»r* 01 cn M cn c w o > ro ro w ro M to cn o - I N) D \J'O 00 ml * ft I -» to o> y u צ -1 -» J NT W X * r %J' J ונ u י-) cn ני o> cn I O to 00 cn OJ cn cn M rf* o o ro ^,^o^cn^ _OJ^ 00 גי ב> ו ו ו ו tf» OJ to H 3 ro - I o J _» + vs.. <» vj" cr + א -* o W X s י- *י_ 1 *- j =1 OJ o cn O סם s to H OJ to 12.0 cn t* OJ rot-* cn > * cn גיגיני 1 י ו ו ו ו *> OJ to t-» o ro O -» I s> O א 3 5 OJ 1 if* 1 OJ גי OJ to co cn ו ו ו ו 4* OJ ro v 0 cn cn o -«rj t o zt 1 1 -» J cr 19 «י u. zj ZJ _» < %r 3U > -I tl -» 1 zi «3 ZJ -1TJ M* 1 x 0 j -«ZJ *יזי ^י^ -י zj L. cr ti י v» n «- «3 «מ _» q j x -» cr א ו- =» _1 J* 3 «* ZJ vf 3 «י י זז ו 1- -» U _J J u o # o גי _1 j J w u cr X U 19 -J' VJ o ct צ כ» v vt _» -» ZJ «O U C/ J י ZJ ZJ ZJ zj * גי 1_ o J J-J u o «ט u J «י 4 י «* 3 - Z J u ZJ 1- V -» c - ZJ _1 w u VJ. ZJ -» I גי.* X x tr NT «3 U -I tf Tf or 3 3 VJ Cf גי m l X tl X J «3 יגי Vf vt ZJ <* o tl Vf 1 ZJ

45 םבלה_ 6 השפעת מיהולים וחיםום ב f c ע ל השראת לאוקמיה 3 26 ע י נל מ מ K0L (נוזל היומ ה 52 ) זז העכבר י ם גיל העכברי ם בזמן ההזרקה (ימים) ה חומר המוהל מספר העכבר י ם הלא ו קמי י ם מספר העכברים המו זרקי ב הזמן להד פעת הלאוקמיה הראשונה (חודשים) הזמן עד לקבלת 50$ לא דקמיה ) חודשי ם) משך ההםתכלו ת (חודשי ס) המסמר הניסויי 33B A B C D E mm י. יי /3.4 9/15 1/15 0/15 0/11 14/14 7/15 6/14 0 " ש.ב.ז לים מיהו כפולי מייא 10 20$ סרים םום Swl3s A /10 7/8 8/8 0/8 0/ ם.ב.ז BALB/c 33* 1 c : י 6/10 10 / 1)8 ) 9/9 0 1/2 1 6 חמום ב- 37 C (שעות) /17 14/14 16/16 4/9 8/17 C=ssrss3sss=s=:s3s 0 1/ Swiss (1) עכבר אחד מת במשך תקופת ההסתכלות ללא סימני לאוקםיה.

46 ז u I 60 o E 50! Undiluted ' h y _L _L S 6 7 Months fter Inocultion 8 10 עקומה מם. - 1 זמן הופעת הלאוקמיה לאחר הזרקת עכנוי^ /^ 6 מבוגרים בנוזל היום ה- 52 של 1/1^26 /_הבלתי מהול והמחול ל- 1 ^! ול (ניסוי מם. * 33 טבלה 6)

47 במידה מםוימת ולאבד חלק מכושרו לאחר חימום ב 37 0 י דגימה של הנוזל הזוז 6 שעות גרמה עדיין ל- לאוקמיות ) 9 / 9 נ י ם ו י c33, 3 עקומה 2) כשהתקופה הלטנטית היתה ארוכה קצת יותר. מאחד ובניסוי 58 (טבלה 5) היה בכל זאת שעור גבוה יותר של לאוקמיות בנוזלים המהולימ למרות חימומם למשך חצי שעה עם היאלורונידזה יש להניח, זמנית, שחימום ב 0 37 לזמן הנבדק מפרק רק חלקית את הגורם המפריע להשראת הלאוקמיה בעכברים מבוגרים. בניסוי אחר (ניסוי 59) הוזרק הנוזל המחומם לגורי עכברים מזן. 6 שעות ב- c37 אך נתקבלו עדיין 8/17 לאוקמיות לאחר חימום למשך 24 שעות. העברת_הנi2 ב_בתרב 2 בפ_ 2 ל_פא 2_2 בבכ_ב 22 לה תרביות של תאי עובר עכבר וכליות מעכברי Swiss הודבקו במאגרים stocks) ( שונים של נל מ. לא הובחן בכל השפעה ציטופטית או בשינוי מורפולוגי כלשהוא של התאים, באותם התנאים שנבדקו עד היום. ייצור הנגיף ע י התאים של תרביות אלו נבדק עייי הזרקת נוזלי התרביות לגורים מזן.Swiss התוצאות ניתנות בטבלה 7. הנתונים מראים שאפשר להעביר בהצלחה את הנליימ על תאי עובר ועל תאי כליה, דבר המשתקף ביכולת הלאוקמוגנית הגבוהה של העבדות אילו. בניסוי מם. 37 הודבקו התאים שהורחפו ע י טריפםין בנוזל היום ה- 43 של ימים 7 בכל. 26L0M והתאים הודבקו בשניה עם אותו מאגר של הנגיף כעבור התרביות הוחלף כל המדיום (4 םמ ק) פעמיים בשבוע. _ 2^jjטי A צ 522 j1j*y אם ^? J ^ {^ L^cit_22"2 _פ לםמה_מע כ בי 2 ם_לא^ מ 22 ם^ לשם השוואה לניסויים עם תרביות הרקמה, נבדקו גם תמצית חופשית מתאים, נוזל אםציטי ופלסמה להשראת לאוקמיה ע יי הזרקה לגורים של.Swiss התמצית הוכנה מתרחיף בן 10$ של תאי טחול ובלוטות לימפה מעכבר Swiss לאוקמי 7 בנל מ מנוזל ש ל, 1 0 L 0 M.התמציתנעשתה ב מ.ב.ז. םורכזה ב ם.ב. ואחרי כן ב הנוזל האםציטי נלקח מעכבר BALB/c שפיתח אסציטם אחרי שהוזרק בתאים של ( 0L50 חלק M א). הנוזל האםציטי עם