הפקולטה לרפואת שיניים של האוניברסיטה העברית והדסה מיסודה של אחוות אלפה אומגה בדיקת שכיחות של נגיף הפפילומה האנושי בשאת ממאירה קשקשית של בסיס הלשון והש

הפקולטה לרפואת שיניים של האוניברסיטה העברית והדסה מיסודה של אחוות אלפה אומגה בדיקת שכיחות של נגיף הפפילומה האנושי בשאת ממאירה קשקשית של בסיס הלשון והשקדים-מחקר רטרוספקטיבי Investigation of frequency of Human papilloma Virus in Squamous cell carcinoma of the base of tongue and tonsils-a retrospective study עבודת הגמר של מתן בר-טוב כמילוי חלק של הדרישות לשם קבלת תואר דוקטור לרפואת שיניים מטעם הפקולטה לרפואת שיניים של האוניברסיטה העברית והדסה, ירושלים. בהדרכתן של: ד"ר צ'רנינסקי רקפת, המחלקה לרפואת הפה, הפקולטה לרפואת שיניים, המרכז הרפואי הדסה עין-כרם ד"ר קפלן אילנה, המכון הפתולוגי, המרכז הרפואי סוראסקי תל-אביב וביה"ס לרפואה ע"ש סאקלר, אוניברסיטת תל-אביב בשיתוף ד"ר מלי אלכסנדר, המחלקה לפתולוגיה, המרכז הרפואי הדסה עין-כרם המחלקה לרפואת הפה הפקולטה לרפואת שיניים, האוניברסיטה העברית והמרכז הרפואי הדסה עין כרם. המעבדה לחקר סרטן הראש והצוואר, מרכז רפואי סוראסקי תל-אביב. תאריך: 72.4.14 1

תוכן העניינים מבוא קרצינומה קשקשית של הפה והאורופרינקס אפידמיולוגיה ושרידות... 3 גורמי סיכון של קרצינומת ראש צוואר... 5 נגיף הפפילומה האנושי כגורם לקרצינומה קשקשית פתוגנזה ושרידות... 7 שיעורי ההידבקות בנגיף הפפילומה בעולם ובישראל... 11 מטרות המחקר... 11 שיטות וחומרים חולים... 17 אנליזה היסטופתולוגית... 17 הפקת 11...DNA 11...HPV typing ניתוח סטטיסטי... 11 תוצאות... 22 דיון... 25 סיכום... 21 31...Summary רשימת ספרות... 33 תמונת השער: דגימת Squamous cell carcinoma מהשקד אשר נכללה במחקר בהגדלה של 122X ובה צביעה חיובית לחלבון P16. ניתן לראות כי באזורים החיוביים לצביעה, גם הציטופלזמה וגם הגרעין נצבעו. 2

מבוא קרצינומה קשקשית של הפה והאורופרינקס אפידמיולוגיה ושרידות סרטן הפה הינו אחד מסוגי הסרטן השכיחים ביותר ברחבי העולם, והוא יכול להתפתח בשפה, בלשון, בחיך, ברצפת הפה, ברירית הבוקאלית, בחניכיים ועוד. כ- 12% ממקרי סרטן הפה הם מסוג קרצינומה קשקשית SCC(,)Squamous Cell Carcinoma אשר הינה גידול ממאיר של תאי האפיתל )2012.)Gregoire 2010,Feller ממחקר אשר כלל 111 מדינות עולה כי בשנת 2212 אירעו כ- 322,373 מקרים חדשים של סרטן הפה ברחבי העולם )2.7% מכלל מקרי הסרטן( וכ- 115,321 מקרי מוות מהמחלה. 11.2% מהמקרים החדשים היו של גברים, ו- 17.3% ממקרי המוות היו של גברים.)GLOBCAN WHO 2012( ב- 2221 לעומת זאת, אירעו כ- 213,122 מקרים חדשים של סרטן הפה וכ- 121,222 מקרי מוות בעטיו ברחבי העולם. קיים שוני ניכר בין המדינות מבחינת ממדי התופעה )ראה Figure.)Jemal 2011( )1 שיעור השרידות לאחר חמש שנים של סרטן הפה rate) (relative survival תלוי בדירוג הקליני של הגידול ומשתנה בין האתרים השונים: שפה 11-11%, לשון 37-71%, רצפת הפה,32-73% חניכיים ושאר הפה society( 12-11%.)2211 American cancer 3

Figure 1. Age standardized oral cavity cancer incidence rates by sex and world area (Jemal 2011). סרטן של האורופרינקס עלול להתפתח במספר אתרים, כשאחד העיקריים שבהם הוא אפיתל השקדים. רוב מקרי הסרטן האורופרינקס הינם מסוג National Cancer Institute( SCC.)2211 בשנת 2212 אירעו כ- 112,317 מקרים חדשים של סרטן האורופרינקס והלרינגופרינקס )היפופרינקס( ברחבי העולם )1.2% מכלל מקרי הסרטן( וכ- 11,212 מקרי מוות מהמחלה. 12.1% מהמקרים החדשים היו של גברים, ו- 12.7% ממקרי המוות היו של גברים.)GLOBCAN WHO 2012( שיעורי השרידות לאחר חמש שנים של סרטן האורופרינקס והשקד בארה"ב ( Relative American cancer הינם תלויים בדירוג הקליני ונעים בין ( 13-51% )survival rates.)2211 society הנתונים לגבי מחלת הסרטן בישראל נאספים ברישום הסרטן הלאומי. היארעות סרטן הפה בקרב הגברים הישראלים ב- 2221, על פי רישום הסרטן הלאומי, הייתה 113 מקרים לשנה )1.35% מכלל מקרי הסרטן( ו- 121 מקרים לשנה בקרב נשים )1.06% מכלל מקרי הסרטן(. היארעות סרטן הפרינקס בשנה זו בקרב הגברים הישראלים הייתה )2.12% 51 מכלל מקרי הסרטן( ובקרב הנשים )2.12% 11 מכלל מקרי הסרטן( ( Cancer Israel National.)Registry 2006 SCC מהווה 11.1% ממקרי הסרטן האוראלי בישראל, ושיעור השרידות לאחר שנים חמש של החולים אשר פיתחו גידולים מסוג זה הינו מעט יותר מ- 12% )2010.)Zini 1

גורמי סיכון של קרצינומת ראש צוואר קיים קשר ברור בין הסיכוי לחלות בסרטן של חלל הפה לבין הרגלי עישון או לעיסת טבק והרגלים של צריכת אלכוהול )2003.)D'souza,2007 Herrero הוערך כי ברחבי העולם עישון טבק גורם ממקרי סרטן הפה בנשים )2006.)Parkin לכ- 11% ממקרי סרטן הפה בגברים, ולכ- 11% יחד עם זאת, נראה כי יש מקרים רבים של קרצינומה קשקשית של ראש-צוואר HNSCC( )Head and Neck Squamous Cell Carcinoma אשר אינם קשורים לצריכת טבק ואלכוהול )2013.)Curado בנוסף, נראה כי לאורך 25 השנים האחרונות חלה עלייה בשכיחות,HNSCC וזאת למרות ירידה מתמשכת בצריכת טבק ואלכוהול ( Montero 2012(. ממצאים אלו תומכים בקיום גורמים נוספים להתפתחות המחלה. הקשר בין נגיף הפפילומה האנושי HPV( )Human Papilloma Virus וממאירות בצוואר הרחם הוכח כבר באופן חד משמעי בספרות, והיה הגורם שזירז את פיתוח החיסונים השונים נגד.)Bosch 2222( HPV הנוכחות של HPV בחולי HNSCC משתנה, כתלות באוכלוסייה, סוג הדגימה ושיטת הבדיקה. נמצא כי קיים קשר בין רמת סיכון גבוהה יותר לסרטן באורופרינקס לבין יחסי מין עם מספר גבוה של שותפים, כשככל שמספר השותפים עלה, כך רמת הסיכון עלתה.)D'souza 2007( במחקר שבוצע בין השנים 2222-2221 בארה"ב בקרב חולי HNSCC נתגלה כי לחולים עם גידולים חיוביים ל- HPV16 )12 מתוך 212 חולים(, מספר גדול יותר של שותפים למין אוראלי ועישון מריחואנה כבד ורב יותר בעברם. לעומת זאת, לחולים השליליים לזן זה, היסטוריה הכוללת עישון טבק, שתיית אלכוהול והיגיינה אוראלית לקויה. מסקנת המחקר היא כי בשל האמור לעיל, גידולים סרטניים חיוביים לנגיף ואילו ששליליים אליו אמורים להיחשב כשני סוגים שונים של המחלה )2008.)Gillison משתנים אשר יכולים להסביר את ההיארעות הנמוכה של קרצינומה קשקשית של האורופרינקס OPSCC( )OroPharyngeal Squamous Cell Carcinoma בישראל הם שיעורים נמוכים יותר של צריכת טבק ואלכוהול, שיעורים נמוכים יותר של חשיפה ל- HPV, זיהום ע"י זני HPV בסיכון נמוך יותר וגורמים גנטיים פרוטקטיביים אשר יכולים להיות ייחודיים לאוכלוסייה הדרוזית, הערבית או היהודית )2013.)Ostrer יחד עם זאת, יש לציין כי איננו יודעים בדיוק מהו הגורם לשכיחות השונה של היארעות.OPSCC 5

אם נבחן את גורמי הסיכון המסורתיים לOPSCC, ניתן לראות כי על פי דו"ח שר הבריאות על העישון בישראל 2211, קיימת מגמת ירידה בשיעורי העישון בישראל מאז תחילת שנות השבעים )דוח שר הבריאות על העישון בישראל 2211(. לעומת זאת, שיעור הישראלים שצורכים אלכוהול נמצא במגמת עלייה דווקא בקרב בני הדור הצעיר. ממחקר שנערך ב- 2227 עולה כי שיעור צריכת האלכוהול בקרב בני נוער בישראל הוא בין 52-12%, וניכר שחלה עלייה משמעותית בשיעורי שתיית האלכוהול בקרב בני נוער מאז שנת 1111 )מרכז המחקר והמידע בכנסת צריכת אלכוהול בקרב ילדים ובני נוער.)2221 1

נגיף הפפילומה האנושי כגורם לקרצינומה קשקשית פתוגנזה ושרידות כיום, מעורבותו של HPV כגורם ל- HNSCC ובייחוד ל- OPSCC הינה עובדה מבוססת )2003.)Curado,2013 Pillai,1999 Herrero לחולה עם גידול שהינו חיובי ל- HPV יש פרוגנוזה טובה יותר מזו של חולה שהגידול שלו שלילי לנגיף. זאת בין השאר בשל תגובה טובה יותר לטיפולי הקרנה )2008.)Fakhry,2008 Gillison גנים E6 ו- E7 של HPV מתבטאים באופן קבוע בסרטן צוואר הרחם הקשור ל- HPV. נמצא כי E6 מקודד לחלבון המעכב את P53 tumor suppressor protein ואילו E7 מקודד לחלבון המעכב את.Retinoblastoma tumor suppressor protein הפעולה של החלבונים הללו מובילה לחוסר יציבות גנטית ושינויים תאיים הגורמים להתפתחות הממאירות )ראה.)Figure 2 אינטגרציה של הגנום של HPV בתוך ה- DNA התאי מתרחשת לעיתים קרובות בסרטן פולשני של צוואר הרחם. היא משבשת את E1/E2 open reading frames בגנום הנגיפי וכך גורמת לביטוי יתר של האונקוגנים E6 ו- E7. HPV נמצא גם באיזורים אחרים כגון התעלה האנאלית, הוגינה והפין. זאת למרות שבאיזורים הללו HPV נמצא קשור אך ורק לחלק קטן ממקרי הסרטן. תרומתו של HPV למקרי סרטן באיזורים הלא-גניטליים עדיין לא ברורה מספיק. בעזרת בדיקת PCR שהינה רגישה ביותר אך גם מועדת לטעויות, נמצאו מקטעי גנום של HPV ברקמות סרטניות מאיזורים לא-גניטליים רבים כגון מעי גס, פרוסטטה, שד, שחלה, ושט ועוד )1998.)Shah Figure 2. A model for the interaction of HPV E6 and E7 with the DNA damage pathway (Kumaraswamy 2011). 7

במחקר שנערך בקרב חולי OPSCC ב- stage 3 ו- 1 אשר קיבלו טיפולי הקרנה וכימותרפיה, נמצא כי שיעור השרידות לאחר 3 שנים היה 12.1% בקרב החולים החיוביים ל-,HPV לעומת 57.1% בלבד בקרב החולים השליליים ל- HPV. כמו כן, מהתוצאות עלה כי כל שנת קופסא מעלה את הסיכון למוות. המחברים השתמשו בארבעה משתנים לצורך סיווג רמת הסיכון למוות: סטטוס,HPV שנות קופסא, ה- stage של הגידול וה- stage.nodal גידול החיובי ל- HPV היה נפוץ יותר בקרב החולים שמעולם לא עישנו ובקרב בעלי המספר הנמוך ביותר של שנות קופסא. כמו כן, תוצאה חיוביות לבדיקת ה- HPV נמצאה כקשורה למספר גורמים נוספים הקשורים לפרוגנוזה מועדפת: גיל צעיר יותר, גזע לבן, performance status טוב יותר, חסר אנמיה, גידולים ראשוניים קטנים יותר. מסקנת החוקרים הייתה כי ראשית, סטטוס הנוכחות של HPV בגידול הינה פקטור פרוגנוסטי עצמאי בכל מה שנוגע לשרידות. במילים אחרות, גידולי OPSCC החיוביים או השליליים ל- HPV הינם ישויות נפרדות ונבדלות זו מזו מבחינת הגורמים, גורמי הסיכון ושיעורי השרידות שלהן )ראה.)Figure 3 בנוסף, הם ראו קשר ברור בין סטטוס הנוכחות של HPV בגידול כפי שעלה מ- hybridization,in situ לבין ביטוי חלבון p16, שהינו ביומרקר לפעילות של האונקופרוטאין.HPV E7 הבדיקה לחלבון זה משמעותית גם משום שאינה ספיציפית לזן מסויים של הנגיף, בניגוד לבדיקת ה- hybridization in situ )ולבדיקות אחרות(. השרידות המשופרת של החולים שגידוליהם חיוביים ל- HPV נובעת בין השאר מ- local regional control גדולה יותר, המשקפת רגישות אינטרינזית גדולה יותר להקרנות או רגישות גבוהה יותר להקרנות עם השימוש ב- Cisplatin. למרות שהתגובה של החולים שגידוליהם חיוביים ל- HPV ל- Cisplatin הייתה משמעותית יותר, טיפול ב- Cisplatin בלבד לא השפיע על שתי הקבוצות באופן שונה מבחינת האפקט על גרורות סמויות. יחד עם כל האמור לעיל, ולמרות השוני הגנטי בין גידולים החיוביים והשליליים ל- HPV, לא נמצא מנגנון ספיציפי המסביר את השוני בתגובת שתי קבוצות הגידולים להקרנות וכימותרפיה. לסיכום ציינו החוקרים כי שילוב של סטטוס הנוכחות של,HPV שנות הקופסא וה- stage של הגידול יוכל לשמש לשם סיווג המטופלים לרמות סיכון למוות כתוצאה מהמחלה )2010.)Ang 1

מחקר נוסף אשר בדק שרידות של חולי SCC 1 של ה- pharynx או של ה- supraglottic larynx,מצא גם כן הבדלים גדולים בין החולים שגידוליהם חיוביים לחלבון p16 לבין החולים שגידוליהם שליליים )בבדיקה אימונוהיסטוכימית לחלבון )p16 )ראה ביטוי מיקרוסקופי ב-.)Figure 4 זאת לאחר ש- 22% מהדגימות של החולים שנכללו במחקר )151 חולים( ביטאו את חלבון ה- p16, כשהדגימות מהאורופרינקס ביטאו את השיעור הרב ביותר של מעורבות 32% HPV היה Figure 3. Data on overall survival and progression-free survival are shown according to stratification on the basis of tumor HPV status (Panels A and B, respectively) or p16-expression status (Panels C and D, respectively). Patients with HPV-positive tumors had significantly better overall survival and progression-free survival than did patients with HPV-negative tumors (P<0.001 for both comparisons by the two-sided log-rank test). The results were similar with stratification according to p16-expression status (Ang 2010). 71 מתוך 12% אל מול 21% דגימות. שיעור ה- survival overall של החולים השליליים לחלבון. שיעור ה- של החולים החיוביים לחלבון disease specific survival של החולים החיוביים לחלבון היה 31% מול 72% של החולים השליליים. במחקר הקודם שהוצג, גם במחקר זה מסקנת החוקרים הייתה כי ביטוי של P16 כמו נמצא כקשור לתגובה טובה יותר לטיפול ולשרידות משופרת, וכי ביטוי החלבון הינו פקטור פרוגנוסטי עצמאי שהינו אפילו חזק יותר מפרמטרים קליניים כגון ה- stage וה- status nodal של הגידול. נראה מהמחקר כי הגידולים החיוביים ל- P16 השליליים. יותר להקרנות רגישים מאלה גם במחקר זה, החוקרים מציינים כי הסיבה המדויקת להבדל בין הקבוצות אינו ידוע. כמו כן, ציינו החוקרים כי הם מאמינים שביטוי של P16 הינו ביומרקר מהימן לזיהום של בגידולים מסוג HPV HNSCC )ראה.)Table 1 מעבר לכך, יכול להיות שנוכחות P16 מצביעה על זיהומי HPV שהינם רלבנטיים לתהליך הקרצינוגנזיס ב- HNSCC )ושבהם HPV

הינו פעיל מבחינת תהליך הטרנסקריפציה(. החוקרים ציינו כי ביטוי P16 אינו מוגבל רק לגידולים החיוביים לנגיף, וששימוש בו כמרקר יחידי טומן בחובו קבלת תוצאות false-.negative החוקרים מסכמים את דבריהם בכך שסטטוס ההתבטאות של P16 צריך להיות גורם חשוב בקביעת אסטרטגיות טיפוליות לחולים עם HNSCC בעתיד )2221.)Lassen Table 1. Correlation Between HPV16 DNA In Situ Hybridization and p16 Immunohistochemistry in Tonsillar Carcinomas (Lassen 2009). Figure 4. (A) HPV16 DNA-positive tonsillar carcinoma. Numerous tumor cells show positive nuclear signals. (B) The same tumor showing strong specific tumor cell expression of p16. (C) HPV16-negative tonsillar carcinoma. (D) The same tumor showing no expression of p16. (A, C) HPV16 DNA in situ hybridization. (B, D) Immunohistochemistry with antip16ink4a antibody clone JC8. (Lassen 2009) 12

שיעורי ההידבקות בנגיף הפפילומה בעולם ובישראל קיים שוני בין מדידות שונות של שיעור שכיחות זיהום ב- HPV, וזאת כתלות במיקום ראשוני של הגידול, השנה בה נערך המחקר ושיטת הבדיקה (,2007 Clifford,2005 Dunne.)Pagliusi 2001, Klug 2008 המקור להעברת הנגיף לחלל האוראלי הינו ככה"נ האיזור הגניטלי הנשי. בבדיקת זני ה- HPV הגורמים לסרטן צוואר הרחם עלה כי 11 ו- 11 הינם הזנים ברמת הסיכון הגבוהה ביותר לסרטן צוואר הרחם, ונחשבים לקרצינוגנים )2003.)Munoz במחקר בין לאומי שבחן נוכחות HPV בדגימות מצוואר הרחם של 15,113 נשים מ- 11 מדינות, נמצא כי 1.2% היו נגועות ב- HPV. היה שוני רב בין המדינות, כשבניגריה השיעור הגבוה ביותר של נשים הנגועות בנגיף )21.7%( ובספרד השיעור הנמוך ביותר )1.3%(. 1.1% מהנשים הכלולות במחקר היו נגועות ב- HPV בסיכון גבוה, 2.5% ב- HPV בסיכון נמוך, 1.1% ב- 11HPV ו- 2.5% היו נגועות בזן HPV שטרם אופיין )2005.)Clifford בסקירה אודות מקרי סרטן הנובעים מגורם מזהם, נבחנה השפעת HPV על נגעים במספר איזורים וביניהם באורופרינקס ובסיס הלשון. זאת למרות שהנגיף יכול להיות מעורב בגידולי ראש-צוואר נוספים, ומשום שהראיות האפידמיולוגיות מצביעות על כך שהמעורבות הרבה ביותר של הוירוס הינה באורופרינקס ובסיס הלשון. תוך שימוש ב- Polymerase Chain )PCR( Reaction של הרקמה הגידולית, נמצא כי 122% ממקרי סרטן צוואר הרחם נגרמים בשל זנים בסיכון גבוה של הנגיף, וכי הזנים הללו הינם גורם חיוני בהתפתחות סרטן זה. בנוסף, נמצא כי זנים אלו גורמים ל- 52% ממקרי קרצינומת הפין, 11% ממקרי הקרצינומה האנאלית, 13% ממקרי ה- carcinoma,vulvar ו- 72% ממקרי הקרצינומה הוגינלית. אותה הבדיקה נעשתה בגידולים של האורופרינקס, השקד ובסיס הלשון, כאשר נמצאו הבדלים משמעותיים בין המדינות השונות: 51% בצפון אמריקה )הגבוה ביותר(, 31% באירופה המערבית והצפונית, 31% באירופה המזרחית, 17% באירופה הדרומית, 15% באוסטרליה, 52% ביפן ו- 13% בשאר העולם )הנמוך ביותר( )ראה.)Table 2 11

Table 2. Methods for calculation of the population attributable fraction (PAF), by infectious agent and cancer site or subsite. NR = not relevant. These subsites were not directly available in GLOBOCAN 2008; therefore, data from CI5-IX database were used to estimate corresponding incidence rates. (de Martel 2012) נמצא כי מתוך כשני מליון מקרי סרטן חדשים שנרשמו ברחבי העולם ב- 2221 ואשר נגרמו כתוצאה ממחולל זיהומי מסויים, כ- 32% )112,222 מקרים( נגרמו בשל.HPV 122,222 מהמקרים התרחשו במדינות מפותחות יותר )21.2% מכלל המקרים באותן המדינות( וכ- 112,222 מקרים )32.2%( התרחשו במדינות מפותחות פחות. מכאן ניתן ללמוד כי שיעור ההיארעות של מקרי סרטן חדשים אשר נגרמו מ- HPV אינו שונה בין המדינות המפותחות יותר לאלה המפותחות פחות )ראה.)de Martel )2012 )Figure 5 12

Figure 5. Number of new cancer cases in 2008 attributable to infection, by infectious agent and development status. (de Martel 2012) בין השנים 1115-1117 בוצעו 11 מחקרים ב- 1 מדינות )אפריקה, דרום אמריקה, אסיה וספרד( בקרב נשים עם SCC של צוואר הרחם, הן פולשני והן.in-situ הדגימות אשר נלקחו מהנשים נבדקו להימצאות HPV בעזרת PCR ולאחר מכן.oligohybridization מסקנת החוקרים הייתה כי 11,11,31,33,35,31,15,51,52,51,51,51,11,73 ו- 12 הינם זנים בסיכון גבוה )כלומר, קרצינוגנים(. 3 זנים סווגו כזנים בסבירות גבוהה לסיכון גבוה: 21,53 ו- 11. 12 זנים נוספים סווגו כזנים בסיכון נמוך )ראה.)Munoz )2003 )Table 3 Table 3. Epidemiologic classification of HPV types as probable highrisk types. (Munoz 2003) 13

סרטן של צוואר הרחם נגרם על ידי זני HPV השייכים למספר זנים בסיכון גבוה ואשר שייכים לסוג האלפא המוקוזוטרופי )אלפא 5,1,7,1,11(. בשכיחות הגבוהה ביותר בסרטן צוואר הרחם נמצאו הזנים,HPV 16,18,31,33,35,45,52,58 ובנוסף נמצאו ארבעה זנים שאותם ניתן למצוא בשכיחות נמוכה יותר )39,51,56,59 )HPV )ראה.)Table 4 הסיכון ללקות בסרטן צוואר הרחם גבוה יותר עם ההדבקה בזן 11 של הנגיף מאשר בזנים אחרים שהינם בסיכון גבוה )2009.)Bouvard Table 4. HPV types assessed by the IARC Monograph Working Group (Bouvard 2009) במחקר שבוצע בישראל ב- 2225 ובו נבדקו Scrape specimens של 11 נשים, נמצאו 11% מהבדיקות חיוביות ל- HPV בסיכון גבוה. זני ה- HPV השכיחים ביותר היו )11% 11 מהנשים הנגועות בנגיף בסיכון גבוה(,,)11%( 11 31 )22%( ו- 52 )11%( ( Grisaru.)2008 ישראל נחשבה מאז ומעולם לבעלת השכיחות הנמוכה ביותר של סרטן צוואר הרחם הנגרם מ- HPV בהשוואה לעולם המערבי )1989,)Glezerman אלא שבמחקר שבוצע אודות הנושא נמצא כי רמת השכיחות נעשתה דומה לזו שבמדינות מערביות אחרות ( Sadan.)2004 קיים קשר בין שכיחות HPV בגניטליה לבין שכיחותו בחלל הפה. במחקר שבוצע בארה"ב ב- 2227 ואשר בדק הימצאות HPV אוראלי בקרב 212 סטודנטים גברים בריאים שלא חוסנו כנגד הנגיף בין הגילאים 11-23, נמצאה שכיחות של 2.1%.)D'souza 2009( 11

שיעור השכיחות הגבוה ביותר של HPV הינו בגידולים ממאירים של השקד ובסיס הלשון, ושם ניתן למוצאו בעד ל- 15% מהמקרים )2006 11HPV.)Parkin ו- 11 הינם המינים הבולטים שהתגלו באירופה ובצפון אמריקה ( Gillison Smith 1998, Franceschi 1996,.)2008, Schwartz 1998 במחקר שנערך בקנדה בין השנים 2222-2212, שיעור ה- Oropharyngeal cancer מכלל מקרי ה- HNSCC עלה מ- 23.3% ב- 2222 ל- 31.2% ב- 2212. נראתה נטייה של דגימות החיוביות ל- P16 להיות מחולים צעירים יותר, בעלי הרגלי שתייה קלים או מתונים יותר, עם פחות שנות קופסא או שמעולם לא עישנו, ושמקורן מהשקד או מבסיס הלשון. נראה ששכיחות HPV )על סמך הימצאות חלבון P16( בגידולים מבסיס הלשון והשקד מגיעה ל- 11% בעוד שבשאר אזורי הפה שיעור השכיחות הוא )2013 1%.)Habbous 12- על פי מחקר נוסף, נראה כי שיעור הסרטן באורופרינקס המיוחס ל- HPV בארה"ב הינו.)Shah 1998( 52% לפי ה- registry Danish Cancer התרחשה עלייה של פי 3 בהיארעות סרטן השקד בדנמרק לאורך 32 השנים האחרונות, ובנוסף לכך, קיימים דיווחים דומים ממדינות אחרות בעולם המערבי. זאת, כאשר ידוע כי קיים קשר חזק בין HPV ל- HNSCC באורופרינקס ובמיוחד בשקד. העלייה הנ"ל חלה באותה התקופה בה חלה ירידה משמעותית בקרצינומות של הריאה והלרינקס אשר נגרמות מצריכת טבק. ההשערה היא כי העלייה הנ"ל חלה בשל עלייה בגידולים עם מעורבות.HPV אם התיאוריה הנ"ל נכונה, אנחנו עומדים בפני עלייה ניכרת בקרצינומות של האורופרינקס )2009.)Lassen רוב המחקרים אודות הקשר בין HPV ל- SCC בוצעו בארצות המערב, ולכן לא ניתן לדעת האם אותם הגורמים קיימים גם באיזורים אחרים דוגמת המזרח התיכון )2005.)Clliford 15

מטרות המחקר זיהוי וסיווג זני נגיף הפפילומה האנושי אשר מעורבים בהתפתחות ממאירות ברקמות קרצינומה קשקשית בבסיס הלשון ובשקדים, בקרב קבוצת חולים בישראל. אפיון מדדים קליניים הקשורים לקרצינומה קשקשית שהינה חיובית לנגיף הפפילומה האנושי..1.2 11

שיטות וחומרים חולים במחקר זה נכללה קבוצת חולים מהמרכז הרפואי הדסה עין כרם, וזאת כחלק ממחקר רב מרכזי הכולל גם את המרכז רפואי רבין בפתח תקווה, המרכז הרפואי תל אביב ע"ש סוראסקי, בית החולים הצרפתי בנצרת והקריה הרפואית רמב"ם בחיפה. דליית המקרים שנכללו במחקר בוצעה באמצעות חיפוש במאגר הנתונים של המרכז הרפואי הדסה עין כרם, אחר חולים אשר עברו ניתוח ראשוני או ביופסיה ואובחנו עם SCC של בסיס הלשון ו/או השקדים תנאים להוצאת הדגימה מהמחקר: ממאירות שאינה,oropharyngeal cancer סרטן ראשוני נוסף וטיפול נגד סרטן שבוצע לפני הגעת החולה ל"הדסה". הדגימות אשר נבחרו למחקר נבדקו על מנת לוודא כי הן עדיין זמינות עבור המחקר ומכילות חומר גידולי. בנוסף, נבדק האם עבור כל אחד מהחולים היה חומר רפואי זמין לשם איסוף הנתונים. לשם ביצוע המחקר, התקבל אישור של ועדת הלסינקי המוסדית מספר.0535-11-HMO עבור כל אחד מהחולים שנכללו במחקר בוצע איסוף נתונים הכולל: תאריך לידה, מין, גיל בעת ביצוע הניתוח או הביופסיה, מיקום, דירוג קליני של הגידול,)stage( אופן הטיפול במחלה )הקרנות ו/או כימותרפיה(, הרגלי עישון )שנות קופסה(, הרגלי שתיית אלכוהול, מוצא אתני, אבחנות נוספות ושרידות. אנליזה היסטופתולוגית אימונוהיסטוכימיה התבצעה על חתכי 1 מיקרון שנחתכו מבלוקים של רקמה אשר קובעו ע"י פורמלין ושוקעו בפראפין, וזאת באמצעות נוגדנים מונוקלונליים כנגד MTM ( p16 Ventana Benchmark LT automated על )Laboratories; monoclonal; 1:1 dilution USA),immunostainer (Ventana Medical Systems, Tucson AZ, ועל פי הפרוטוקול התקני. הבדיקה בוצעה בעזרת ב- Kit Ventana's ultraview Universal DAB Detection אשר עושה שימוש בתמהיל של נוגדנים שניוניים המסומנים על ידי אנזימים ואשר מאתרים את הנוגדנים הראשוניים אשר עברו קישור לדגימה. לאחר שלב זה, ניתן לצפות בקומפלקס על ידי hydrogen peroxide substrate ו- 3 -diaminobenzidine tetrahydrochloride 3,.(DAB) chromogen לא בוצע שום שימוש בביוטין. 17

לשם איחזור האנטיגן, על פי התקן של מכשיר הונטה, נעשה שימוש בתמיסת Ventana.CC1, EDTA-Tris, ph 8.0 עם כל חזרה על התהליך, דגימה של HNSCC שידוע כי היא חיובית ל- p16 שימשה כביקורת חיובית, וחתכים של שקד נורמלי שימשו כביקורת שלילית. הפתולוגית של המחקר )ד"ר אילנה קפלן( עברה באופן עצמאי על המקרים, ללא ידיעת תוצאות בדיקת ה- HPV. רק תאי גידול בהם גם הגרעין וגם הציטופלזמה נצבעו נחשבו כחיוביים )ראה.)Figure 4 המקרים סווגו באופן דיכוטומי כחיוביים או שליליים, ללא התחשבות באחוז התאים החיוביים בדגימה. זאת שכן במקרים החיוביים מרבית תאי הגידול נצבעו, ובכל המקרים השליליים הייתה צביעה של 2-1% מתאי הגידול, ללא מקרי ביניים. במחקר הכללי חולקו הדגימות לשליליות אשר בהן אין צביעה לחלבון, חיוביות פוקאליות המבטאות צביעה של קבוצת תאים בחתך, וחיוביות קונפלואנטיות המבטאות צביעה שהינה מפושטת יותר על כלל אזורי החתך. הפקת DNA לפני הפקת ה- DNA, הוצאו חתכים של 5 מיקרון מכל בלוק פרפין, עברו דפרפיניזציה ב-,xylene נשטפו מספר פעמים באתנול, ועובדו במשך לילה אחד עם Proteinase K ב- 51 מעלות צלזיוס Germany(.)Qiagen GmbH, ביום שלמחרת, הופק ה- DNA באמצעות.modified phenol-chloroform method התהליך בקצרה: הדגימות הושרו בפנול, כלורופורם ו- alcohol isoamyl )יחס של 25:24:1(, עברו spin down והפאזה העליונה נאספה. לשם שיקוע ה- DNA, הוסף לדגימות 3 מולר של סודיום אצטאט ל- 122% אתנול קר כקרח, שלאחר מכן הושמו במקפיא ב-) 20 -( מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפני ה- spin.down ה- pallet נשטפה מספר פעמים באתנול וריכוז ה- DNA שנגרם מהפעולה נבחן על ידי.)Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA( Nano-Drop דגימות ה- DNA אוחסנו ב-) 20 -( מעלות צלזיוס עד לביצוע ההגברה לשם בדיקת ה- HPV. HPV typing בדיקת HPV בוצעה על ידי (Innogenetics, HPV INNO-LiPA Genotyping Extra kit Belgium) המבוסס על עיקרון ה- hybridization,reverse וזאת בהתאם להוראות היצרן. התהליך בקצרה: ה- DNA של הדגימה הוגבר על ידי.HPV INN-LiPA Amp kit לאחר מכן תוצרי ה- PCR עברו דנטורציה והיברידיזציה עם type specific HPV probes שיצרו linear array על סטריפים. בכל חזרה על תהליך ה- PCR הייתה ביקורת חיובית וביקורת שלילית. היברידיזציה חיובית נראתה כמשקע של צבע במיקום של הפרוב ומין הנגיף נקבע על ידי כיסוי הייחוס. התוצאות נקבעו באופן ויזואלי בהתאם לתבנית שנראתה על הסטריפ, וזאת תוך שימוש בסטריפ ביקורת חיובית. 11

ניתוח סטטיסטי לשם בחינת הקורלציה של גילוי HPV עם משתנים כגון מין, גיל, מיקום ראשוני, דירוג הגידול, סיווג TMN והיסטוריה של צריכת טבק ואלכוהול, נעשה במסגרת המחקר הכללי שימוש בחי בריבוע ובמבחן המדויק של פישר. כל ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנת )SAS institute Inc. cary, NC( JMP10 ואומתו על ידי סטטיסטיקאי. במחקר מ"הדסה", חולים אשר לא היה פירוט בתיקם לגבי קיום או אי קיום היסטוריה של שתיית אלכוהול, נכללו בטבלה תחת הקטגוריה של החולים אשר לא נהגו לשתות אלכוהול בעברם. במחקר הכללי בוצעה חלוקה של הרגלי שתייה כבדים וקלים, כששתיית אלכוהול כבדה משמעותה יותר מ- 2 משקאות ביום. 11

תוצאות לאחר עבודת סינון נרחבת, אותרו 17 מחולי המרכז הרפואי "הדסה" אשר ענו על הקריטריונים ונכללו במחקר. הדגימות מהחולים הללו נלקחו בין השנים 1112-2222. במחקר שבוצע ב"הדסה" נכללו 13 חולים, בעוד שבמחקר הכללי נכללו 71, כך שהממצאים מ"הדסה" מהווים 17.1% מכלל הממצאים במחקר הרב מוסדי. בעבודה זו אתייחס גם לממצאים מהמחקר הכללי )ראה ב- 5 Table פירוט התוצאות משני המחקרים(. מחקר כללי HPV שלילי N)%( HPV חיובי )%(N 49 25 29 (59) 18 (72) 20 (41) 7 (28) 62 49 14 14 34 (69) 17 (68) 6 (12) 5 (20) 9 (19) 3 (12) 36 (73) 17 (68) 13 (27) 8 (32) 20 (45) 10 (83) 25 (55) 2 (17) 31 (83) 10 (83) 6 (17) 2 (17) 5 (11) 22 (96) 39 (89) 1 (4) 8 (16) 8 (32) 22 (45) 8 (32) 19 (39) 9 (36) 14 (29) 4 (15) 14 (29) 7 (28) 21 (42) 14 (58) HPV חיובי HPV שלילי N N 9 4 4 2 5 2 67.1 52 17.1 17.9 3 4 3 0 3 0 9 3 0 1 6 3 3 1 9 4 0 0 1 4 7 0 1 0 0 2 1 1 8 1 7 4 9 4 3 1 מין החולים גברים נשים גיל ממוצע סטיית תקן רקע תרבותי יהודי ערבי מזרח אירופה מיקום ראשוני בסיס הלשון שקד עישון לא מעשן מעשן אלכוהול לא נהג לשתות נהג לשתות P16 חיובי שלילי * רמת התמיינות diff. Poorly Moderately diff. Well diff. טיפול ניתוח הקרנה כימותרפיה כלל החולים N 13 6 7 62.5 18.1 7 3 3 12 1 9 4 13 0 5 7 1 2 2 9 11 13 4 כלל החולים N)%( 74 47 (64) 27 (36) 58 15 51 (69) 11 (15) 12 (16) 53 (72) 21 (28) 30 (52) 27 (48) 41 (84) 8 (16) 27 (40) 40 (60) 16 (22) 30 (41) 28 (37) 18 (21) 21 (26) 35 (51) מחקר "הדסה" - Table 5 מאפיינים דמוגרפיים, קליניים ופתולוגיים של חולי המחקר הרב-מוסדי אשר נכללו במחקר. * - הוצא מהמחקר בשל חסר בתאי גידול. 22

במחקר של "הדסה" נכללו 1 גברים ו- 7 נשים. במחקר הכללי נכללו יותר גברים מנשים - 17 מול 27 בהתאמה. הגיל הממוצע של חולי "הדסה" היה 12.5 שנים, כשסטיית התקן היא 11.1, ואילו הגיל הממוצע של חולי המחקר הכללי היה 51 שנים, כשסטיית התקן היא 15. בסך הכל בקבוצת המחקר מ"הדסה" היו שלושה חולים ערבים ותשעה יהודים, זאת שכן אחד מתוך החולים שמוצאם ממזרח אירופה היה איש עסקים רוסי שזהותו הדתית אינה ידועה. תשעה מהחולים שנכללו במחקר של "הדסה" אינם מעשנים כלל ולגבי ארבעה נמצא שהייתה היסטוריה של עישון. 52% מקרב החולים שנכללו במחקר הכללי לא נהגו לעשן ו- 11% נהגו לעשן. נמצא ששישה מהחולים שנכללו במחקר של "הדסה" אינם בעלי היסטוריה של שימוש באלכוהול ולגבי אף אחד משאר החולים, לא נרשם בתיק הרפואי כי הוא בעל היסטוריה של שימוש באלכוהול. לפיכך, כאמור, כולם הוכנסו לטבלה תחת הקטגוריה של החולים שלא נהגו לשתות אלכוהול בעברם. מכלל החולים במחקר הכללי, 11% לא נהגו לשתות אלכוהול, 12% הוגדרו כשתיינים קלים ו- 1% בלבד כשתיינים כבדים. רוב הגידולים היו מאיזור בסיס הלשון. מהגידולים שנכללו במחקר של "הדסה" רק אחד היה מהשקד, ואילו במחקר הכללי 21% מהגידולים היו מהשקד. תשע מהדגימות שנכללו במחקר של "הדסה" היו ברמת התמיינות של,well differentiated שתיים היו ברמת התמיינות של moderately differentiated ושתיים נוספות היו ברמה של.poorly 22% מכלל הדגימות במחקר הכללי הן,Poorly differentiated 11% הן.well ו- 37% הן moderately 32.1% מכלל הנבדקים במחקר של "הדסה" נמצאו חיוביים לבדיקת ה- Genotyping,HPV כולם מזן 11. מתוך 71 מטופלים שנכללו במחקר הכללי, )33.1%( 25 נמצאו חיוביים בבדיקת ה- genotyping - שיעור הדומה למחקר מ"הדסה". 23 מתוך )31.1%( 71 היו חיוביים ל- HPV מזן 11. אחד מהחולים היה חיובי לזן 11, אחד מהם היה חיובי לזן 51, ואחד היה חיובי לשני זנים: 11 ו- 35 )ראה פירוט לפי מיקום הגידול בהמשך(. מתוך ארבעת החולים החיוביים לבדיקת ה- genotyping בקבוצת המחקר מ"הדסה", שניים היו גברים ושתיים היו נשים. במחקר הכללי, מקרב החיוביים לנגיף 72% היו גברים, ואילו מקרב השליליים 51%. ארבעה מתוך חמשת החולים במחקר של "הדסה" החיוביים לבדיקה של נוכחות חלבון P16 חיוביים גם לנגיף )ראה ממצאים מיקרוסקופיים ב- 6-8.)Figures על פי בדיקה זו 11.7% מהחולים )לא כולל חולה שדגימתו הוצאה מבדיקה זו בשל חוסר בחומר גידולי( הם נשאי.HPV מקרב השליליים לחלבון כולם שליליים גם לנגיף. ניתן לומר שהקורלציה בין שתי שיטות הבדיקה array( micro ואימונוהיסטוכימיה( מושלמת במחקר שבוצע על חולי 21

"הדסה" בלבד, פרט לחולה אחד שחיובי לאימונוהיסטוכימיה ושלילי לבדיקת ה- micro.array 31% מכלל הדגימות היו חיוביות קונפלואנטיות, 1% היו חיוביות פוקאליות ו- 12% היו שליליות. מכלל הדגימות החיוביות ל- HPV על פי בדיקת ה- genotyping, 11% היו חיוביות קונפלואנטיות, 1% )דגימה אחת( היו שליליות, ואף אחת מהדגימות לא הייתה חיובית פוקאלית. מבין הדגימות השליליות ל- HPV 2% )דגימה אחת( היו חיוביות קונפלואנטיות, 1% היו חיוביות פוקאליות ו- 11% שליליות. הגיל הממוצע בקרב חולי "הדסה" החיוביים לנגיף היה 52 שנים ואילו בקרב השליליים 17.1. במחקר הכללי, הגיל הממוצע בקרב החולים החיוביים לנגיף היה 11 שנים ואילו בקרב השליליים אליו 12. 11.1% מהיהודים )כולל אלה שמוצאם ממזרח אירופה( שנכללו במחקר של "הדסה" חיוביים ל- HPV, ובקרב הדגימות של החולים הערבים לא נמצאה עדות לנגיף. במחקר הכללי גם בקרב האוכלוסייה הערבית יש הידבקות אוראלית בנגיף. מתוך 11 ערבים, חמישה )15.1%( חיוביים לנגיף, ומהווים 22% מכלל החיוביים לנגיף. זאת בעוד הם מהווים 11.1% מהחולים שנכללו במחקר. לפיכך, מתוך 1 ערבים שאינם מהמחקר שבוצע בהדסה 12.5% חיוביים לנגיף. אחד בלבד מחולי "הדסה" החיוביים לנגיף היה בעל היסטוריה של עישון )25%(, ו -33.3% מהשליליים לנגיף נהגו לעשן בעברם. מכלל החיוביים לנגיף במחקר הכללי, רק 17% נהגו לעשן, ואילו מכלל השליליים לנגיף 55% נהגו לעשן. מתוך חולי "הדסה" שנמצא כי אינם בעלי היסטוריה של צריכת אלכוהול, 2 חיוביים לנגיף, וארבעה שליליים. ישנם 4 חולים השליליים ל- HPV, ובנוסף, על פי תיקם הרפואי לא נהגו לצרוך אלכוהול או טבק )11.1% מהשליליים לנגיף(. ישנו חולה נוסף )11.1% מהשליליים לנגיף( השלילי לנגיף וללא היסטוריה של עישון, אך לא מצוין בתיקו האם לא נהג לצרוך אלכוהול. מקרב החיוביים לנגיף במחקר הכללי, 13% לא נהגו לשתות אלכוהול, 17% הוגדרו כשתיינים קלים ואף אחד מהם לא הוגדר כשתיין כבד. מקרב השליליים לנגיף, 13% לא נהגו לשתות אלכוהול, 11% הוגדרו כשתיינים קלים ו- 1% הוגדרו כשתיינים כבדים )בסה"כ 17% שתיינים(. 22

SCC דגימת.Figure 6 מהשקד אשר נכללה במחקר בהגדלה של 122X ובה צביעה חיובית קונפלואנטית ל- P16. ניתן לראות כי גם הציטופלזמה וגם הגרעין נצבעו..Figure 7 דגימת SCC מבסיס הלשון אשר נכללה במחקר בהגדלה של 122Xובה צביעה שלילית ל-.P16.Figure 8 דגימת SCC מבסיס הלשון אשר נכללה במחקר בהגדלה של X100 ובה נראים תאים החיוביים ל- P16 מפוזרים באופן הטרוגני בין תאים השליליים לחלבון. 23% מהגידולים שנכללו במחקר של "הדסה" ושמקורם מבסיס הלשון נמצאו חיוביים לנגיף. כאמור, קיימת רק דגימה אחת מהשקד ולפיכך לא ניתן להסיק מסקנות מהנתונים בנושא. מתוך 21 הדגימות שנכללו במחקר הכללי ושמקורן מהשקד, 1 חיוביות ל- HPV )31.1%(. 1 מהן חיוביות לזן 11, אחת לזן 11 ואחת נוספת לזן 51. קיימות במחקר 53 דגימות מבסיס 23

הלשון )71.1%( ומתוכן 17 חיוביות ל- HPV )32.1%(, כשכולן חיוביות לזן 11 ואחת מהן חיובית ל- 2 זנים: 11 ו- 35. אף אחת מהן לא חיובית לזן 11. מתוך תשע מהדגימות שנכללו במחקר של "הדסה" ונמצאו ברמת,well differentiated רק אחת חיובית לנגיף. מתוך שתי דגימות ברמת Poorly differentiated כולן חיוביות לנגיף, ומתוך שתי דגימות ברמת moderately differentiated אחת חיובית. מקרב הדגימות החיוביות לנגיף במחקר הכללי, 32% הן,poorly 32% הן moderately ו- 31% הן.well מקרב הדגימות השליליות לנגיף 11% הן,poorly 15% הן moderately ו- 31% הן.well מבין 11 הדגימות שהן,poorly differentiated 52% חיוביות לנגיף ו- 52% שליליות אליו. מקרב 32 הדגימות שהן,moderately 21% הן חיוביות לנגיף )מעט פחות מהשיעור הכללי במחקר(. מקרב 21 הדגימות שהן 32% well חיוביות לנגיף )זהה לשיעור הכללי במחקר(. על פי תוצאות המחקר הכללי, הגידולים החיוביים ל- HPV היו בעלי nodal classification גבוה יותר באופן משמעותי מאלה השליליים לנגיף. לצערי, לא ניתן היה לעשות השוואה דומה במחקר מ"הדסה" בשל חוסר אינפורמציה בתיקי המתרפאים בכל הנוגע לדירוגם הקליני (stage) של הגידולים. כמו כן, לא ניתן היה למצוא מידע מהימן במאגרי הנתונים של "הדסה" לגבי תקופת שרידותם של רוב החולים ולגבי סיבת המוות. 21

דיון לאחרונה נמצא קשר בין נוכחות זני HPV לבין,HNSCC ובמיוחד.OPSCC זאת בעיקר במחקרים שבוצעו בארצות המערב )2012.)Lassen,2009 Feller מחקרים שבוצעו ברחבי העולם, מלמדים כי קיימים שינויים בין מדינות מבחינת שיעורי ההדבקה של HPV ומבחינת הזנים הנפוצים בהן 2012(.)Munoz 2003, Clifford 2005, de Martel מחקר זה הינו חלק ממחקר רב מרכזי אשר מטרתו היא לחקור את הקשר בין SCC של בסיס הלשון והשקדים לבין זנים של HPV בקרב קבוצת חולים בישראל. יש לציין כי קבוצות המחקר שנכללו הן במחקר מ"הדסה" והן במחקר הכללי הינן קטנות מדי מכדי לקבוע מסקנות מרחיקות לכת. נמצא כי ברחבי העולם יותר גברים חולים בסרטן הפה והאורופרינקס מאשר נשים )2012,)GLOBCAN-WHO דבר העולה בקנה אחד עם כך שבקבוצת החולים אשר נכללה במחקר הכללי נכללו הרבה יותר גברים. יחד עם זאת, יש לציין כי במחקר שנערך ב"הדסה" נכללו מספר שווה יחסית של גברים ונשים. קבוצת המחקר של "הדסה" הינה פחות מייצגת בשל מספר החולים הקטן שנכלל בה. כשליש מהחולים בשתי קבוצות המחקר נמצאו חיוביים ל- HPV, כשהזן הדומיננטי ביותר שנמצא הוא זן 11. לפיכך, נראה כי שני החיסונים הקיימים כיום Cervarix( ו- Gardasil ( מתאימים לטיפול בישראל. נמצא כי לגברים שנכללו במחקר הכללי הייתה נטייה חזקה יותר מאשר לנשים לחלות במחלה עם מעורבות.HPV האוכלוסייה הישראלית מאופיינת ברב תרבותיות ובהטרוגניות אתנית. היא מתחלקת ליהודים ממוצאים שונים, מוסלמים, נוצרים, דרוזים ועוד. בנוסף לשונות גנטית שקיימת בין הקבוצות, הן גם נבדלות ממספר בחינות נוספות: מצב סוציואקונומי, תזונה, חשיפה לקרצינוגנים סביבתיים, אורחות חיים, נורמות התנהגות מיניות ועוד. מאד מפתיע לגלות כי במחקר הכללי שיעור החולים החיוביים ל- HPV מקרב החולים הערבים גבוה מעט יותר משיעור זה בקרב החולים היהודים. זאת שכן ניתן לצפות שרקע תרבותי ונורמות התנהגות מינית יכולות להשפיע על שכיחות הנגיף. כמובן שניתן אולי להסביר את העניין בשוני גנטי בין האוכלוסיות )2013 )Ostrer ובתרומה של גורמי סיכון אחרים כגון עישון. זאת שכן ידוע שקיימים הבדלים בין האוכלוסייה היהודית לזו הערבית מבחינת דפוסי העישון )ראה פירוט בהמשך( )דוח שר הבריאות על העישון בישראל 2211(. יתכן שבגלל מספרם הנמוך של הנבדקים, קיים הבדל משמעותי בין אזור ירושלים לשאר חלקי הארץ מבחינת שיעורי המעורבות של HPV בקרב הנבדקים הערבים. יחד עם זאת, יש לציין את האפשרות לפיה ההבדל נובע מכך שהחברה הערבית אשר מגיעה לטיפול בבתי החולים בירושלים )אזור ירושלים, יהודה, שומרון והבקעה( היא מסורתית יותר מאשר 25

החברה הערבית בשאר האזורים. בכל מקרה, ברור כי במידה ויינקטו צעדים טיפוליים מניעתיים לבעייה )חיסון(, הדבר צריך להתבצע בקרב החברה הערבית גם כן. פה המקום להעלות את השאלה לגבי אופן העברת הנגיף למוקוזה האוראלית. האם הוא מועבר אך ורק ביחסי מין אוראליים? האם הוא מועבר ב- kissing open mouth )להלן "נשיקה"(? במחקר שנערך בארה"ב )2221 )D'souze על קבוצת מחקר המורכבת מתלמידי קולג' בגילאים 11-23, נתגלה כי זיהום HPV אוראלי קשור למעורבות הנבדק במין אוראלי או בנשיקה, אבל לא ביחסי מין וגינליים. לפיכך, מסקנת המחקר הייתה כי גם בנשיקה קיימת האפשרות להעברת הנגיף. כמו כן, נמצאה שכיחות גבוהה יותר של זיהום HPV אוראלי בקרב מעשנים. הוצע במחקר כי הקשר בין עישון להימצאות הזיהום יכול להיות בשל השפעה מקומית של העישון על מערכת החיסון במוקוזה האוראלית. סיבה נוספת לקשר בין עישון להימצאות הזיהום יכולה להיות גם נוהג של העברת סיגריה בין אדם למשנהו. בהנחה שמסקנת המחקר אכן נכונה, אנחנו עלולים להיווכח כי זיהום HPV אוראלי יהפוך להיות שכיח יותר ויותר. בנוסף לכך, יש לקחת את עניין העברה באמצעות נשיקות בחשבון לפני ההחלטה על הגיל בו יש לתת את החיסון. קשה להגיע למסקנה בעניין העישון מהמחקר המצומצם יותר שבוצע ב"הדסה", אך מהמחקר הכללי ניתן להסיק כי רואים בבירור שיעור נמוך בהרבה של מעשנים בקרב החיוביים לנגיף כנגד שיעור המעשנים בקרב השליליים אליו )17% מול 55%(. במחקר שנערך בארה"ב, נמצא כי בקרב החולים בסרטן של האורופרינקס אשר חיובי ל- HPV 15.1% מעשנים כעת או שנהגו לעשן בעבר, כשמקרב החולים השליליים לנגיף שיעור זה הינו )2010 73.1%.)Ang מסקירה של מספר מחקרים, נראה כי אכן שיעור המעשנים גבוה יותר בקרב חולי OPSCC השליליים לנגיף מאשר בקרב החיוביים אליו, אך יחד עם זאת העישון הינו יחסית נפוץ גם בקרב החיוביים לנגיף. בנוסף, שיעור החזרה של המחלה הינו הנמוך ביותר בקרב החולים שמעולם לא עישנו )6.1%(, גבוה יותר בקרב חולים שנהגו לעשן בעבר )19.6%( והגבוה ביותר בקרב החולים שמעשנים בהווה )34.8%( )2013.)Mirghani יש לציין כי עם הזמן חלים שינויים בדפוסי העישון של האוכלוסייה, ולפיכך נראה שתמונת המעורבות של משתנה זה עתידה להשתנות. מאז תחילת שנות השבעים קיימת מגמת ירידה בשיעורי העישון בישראל. על פי סקר שבוצע בין השנים 2212-2212, שיעור המעשנים מכלל האוכלוסייה הבוגרת בישראל )גיל 21 ומעלה( עומד על 22.1%. בקרב האוכלוסייה היהודית שיעור העישון הוא 11.7% ואילו בקרב האוכלוסייה הערבית הוא עומד על 25.2%. יש לציין את ההבדלים הגדולים יותר שקיימים בין הנשים לגברים בקרב האוכלוסייה הערבית כשאחוז המעשנים מקרב הגברים הערבים 21

הוא 13.1% ובקרב הנשים הוא 1.7% )דוח שר הבריאות על העישון בישראל 2211(. יתכן כי בצעירותם של החולים הנכללים במחקר, המצב היה שונה. על פי מחקר שנערך בארה"ב, נצפתה עלייה בסיכון לסרטן אוראלי בקרב חולים שנהגו לעשן וגם לשתות אלכוהול. זאת באופן המצביע על יחסי סינרגיזם בין שני המשתנים הללו.)Schwartz 1998( לא נראית במחקר שלנו מגמה משמעותית מבחינת הרגלי שתיית האלכוהול. יש לציין כי באופן כללי נוהגי השתייה באוכלוסייה הישראלית בשנים הרלוונטיות למחקר זה היו מתונים בהרבה מהרגלי השתייה בארצות אירופה וצפון אמריקה, ולפיכך פקטור זה פחות משמעותי מבחינתנו. יש לציין את העלייה שחלה בשנים האחרונות בהרגלי השתייה בחברה הישראלית )מרכז המחקר והמידע של הכנסת צריכת אלכוהול בקרב ילדים ובני נוער 2221(. לפיכך, יכול להיות שבעתיד אנו עלולים לראות יותר מקרי OPSCC הקשורים לשתיית אלכוהול. במחקר שנערך בקרב חולי OPSCC ב- 3stage ו- 1 אשר קיבלו טיפולי הקרנה וכימותרפיה, נמצא כי שיעור השרידות לאחר 3 שנים היה 12.1% בקרב החולים החיוביים ל- HPV, לעומת 57.1% בלבד בקרב החולים השליליים ל- HPV. כמו כן, מהתוצאות עלה כי כל שנת קופסא מעלה ב- 1% את הסיכון למוות ואת הסיכון למוות או לחזרה של המחלה. האפקט הנ"ל משפיע באופן זהה על חולים עם גידולים שליליים או חיוביים ל- HPV. המחברים השתמשו בארבעה משתנים לצורך סיווג רמת הסיכון למוות: סטטוס,HPV שנות קופסא, ה-.nodal של הגידול וה- stage stage גידול החיובי ל- HPV היה נפוץ יותר בקרב החולים שמעולם לא עישנו ובקרב בעלי המספר הנמוך ביותר של שנות קופסא. כמו כן, נצפו מספר גורמים favorable נוספים: גיל צעיר יותר, גזע לבן, performance status טוב יותר, חסר אנמיה, גידולים ראשוניים קטנים יותר.)Ang 2010( על פי תוצאות המחקר הכללי, מעט יותר משליש מקרב הדגימות שנלקחו מהשקד היו חיוביות ל- HPV, ומעט פחות משליש מקרב הדגימות שנלקחו מבסיס הלשון היו חיוביות לנגיף. לפיכך, ניתן לומר ששיעורי המעורבות של הנגיף בשני האיזורים הינם שווים יחסית בקרב קבוצת המחקר. ניתן להסיק מהמחקר שלנו כי קיימת נטייה לדגימות ברמות התמיינות נמוכות יותר להיות חיוביות לנגיף. לעומת זאת, בקבוצה הגדולה יותר של כלל הדגימות במחקר הרב מוסדי, לא נצפתה מגמה משמעותית מבחינת רמת התמיינות התאים. מסקנתנו היא כי נראה שבעניין זה, קבוצת המחקר של "הדסה" קטנה מדי בכדי להיחשב כמייצגת. נראית קורלציה גבוהה בין נוכחות חלבון P16 לבין תוצאות ה- Genotyping P16.HPV הינו )CDK( cycline dependent kinase אשר משהה את מחזור התא על ידי עיכוב חלבוני 27

CDK שתפקידם לזרחן את חלבון ה- RB. במחקר שבוצע על גידולים צרוויקליים וגניטליים, נמצא כי בדגימות עם מעורבות זני HPV בסיכון נמוך קיימת צביעה פוקאלית וחלשה. ב- 15 מתוך 17 הדגימות השליליות לנגיף חלה צביעה, ומתוכן ב- 12 מהדגימות הצביעה הייתה חזקה ודיפוזית. הסברים אפשריים למצב של דגימות שליליות ל- HPV אשר נצבעות בבדיקה האימונוהיסטוכימית ל- p16 : False negative בגנוטייפינג של הנגיף בשל אבדן של האיזור הסאב-גנומי ב- DNA של הנגיף, מספר עותקים נמוך של HPV אשר נמצא מתחת לסף הגילוי של בדיקת ה- PCR ונוכחות תת-זנים חדשים של HPV שאינם מוכרים לנו sano(.)1111 החלבון מבוטא באופן קונסטיטוטיבי באפיתליום הבזלי שבקריפטות השקד. במחקר נוסף נמצא כי אכן P16 היה חיובי ב- 122% מהמקרים בהם HPV היה חיובי, וב- 21% מהדגימות בהן HPV היה שלילי. כמו כן, הופעת הצביעה לחלבון הייתה דיכוטומית. בדגימות השליליות לא נמצאה צביעה כלל, ואילו בדגימות החיוביות נמצאה צביעה חזקה ודיפוזית של הגרעין והציטופלזמה 2008(.)Fakhri תוצאות המחקר הרב מוסדי עולות בקנה אחד עם מחקרים קודמים אשר לפיהם חולים החיוביים ל- HPV נוטים להיות צעירים יותר, עם rate גבוה יותר של nodal metastases וללא היסטוריה של עישון 2013(.)Lin 2013, Stoler 2013, Sivasithamparam 21

סיכום סרטן הפה הינו אחד מסוגי הסרטן השכיחים ביותר בעולם, וב- 2212 כ- 2.7% ממקרי הסרטן בעולם היו מסוג זה. באותה השנה, כ- 1% ממקרי הסרטן בעולם היו מהאורופרינקס והלרינגופרינקס. רובם הגדול של הגידולים אשר מתפתחים בפה או באורופרינקס הינם מסוג.Squamous cell carcinoma מזה זמן רב ידוע כי גידולים מהסוג הנ"ל קשורים להיסטוריה של צריכת אלכוהול וטבק, אולם ממחקרים שבוצעו בזמן האחרון בארצות המערב עולה כי באחוזים גבוהים מהגידולים הנ"ל )עד 15%( נמצאה נוכחות של נגיף הפפילומה האנושי. כמו כן, נמצא בין השאר כי חולים החיוביים לנגיף הינם לרוב צעירים יותר ובעלי פרוגנוזה טובה יותר מאשר אלו השליליים אליו. לחולים החיוביים לנגיף פחות צריכת אלכוהול וטבק בעברם. מטרות מחקר זה היו זיהוי וסיווג זני נגיף הפפילומה האנושי אשר מעורבים בהתפתחות ממאירות ברקמות קרצינומה קשקשית בבסיס הלשון ובשקדים בקרב קבוצת חולים בישראל, ואפיון מדדים קליניים הקשורים לקרצינומה קשקשית שהינה חיובית לנגיף הפפילומה האנושי. מחקר זה הינו חלק ממחקר רב מוסדי אשר כלל 5 בתי חולים. במחקר שבוצע ב"הדסה", נערך חיפוש במאגר הנתונים של המרכז הרפואי אחר חולים שעברו כריתה או ביופסיה של גידולים מסוג Squamous cell carcinoma של בסיס הלשון או השקד. החולים המתאימים למחקר היו אלה שדגימותיהם זמינות בארכיון הפתולוגי ומתאימות לבדיקות המעבדה שביצענו, ושתיקיהם הרפואיים זמינים לשם איסוף הנתונים. כל דגימה עברה בדיקת HPV ובדיקה אימונוהיסטוכימית לנוכחות חלבון P16. Genotyping במחקר מ"הדסה" נכללו 13 חולים, ובמחקר הרב-מוסדי נכללו 71. במחקר מהדסה דגימה אחת הייתה מהשקד ושאר הדגימות מבסיס הלשון. במחקר הכללי 72% מהדגימות היו מבסיס הלשון. על פי הנתונים שנאספו, שיעור המעורבות של נגיף הפפילומה בגידולי Squamous cell carcinoma של בסיס הלשון והשקד בקבוצת המחקר הוא כשליש. נמצא כי הזן הנפוץ ביותר בקרב קבוצת המחקר הוא.11HPV בנוסף, נמצא כי חולים שגידוליהם חיוביים לנגיף נוטים להיות צעירים יותר וללא עבר של עישון סיגריות. אחד הממצאים המעניינים של המחקר הוא כי שיעור מעורבות הנגיף בקרב החולים מהאוכלוסייה הערבית דומה לשיעור זה בקרב החולים מהאוכלוסייה הכללית אשר נכללה במחקר. לאור ממצאים אלו, נראה כי ניתן לשקול ביצוע בדיקת HPV Genotyping כבדיקה שגרתית לחולים צעירים שאינם בעלי היסטוריה של עישון ואשר לקו בגידולי Squamous cell carcinoma של בסיס הלשון או השקד. זאת בהתחשב בעדויות הרבות המצויות בספרות בדבר הפרוגנוזה 21

המשופרת של גידולים החיוביים לנגיף והתגובה המשופרת שלהם לטיפולי הקרנות ביחס לגידולים השליליים אליו. יש לבצע בארץ מחקרים נוספים בנושא. לדעתי, ראוי כי יהיו אלה מחקרים פרוספקטיביים אשר יכללו מספרים משמעותיים יותר של חולים ואשר יאפשרו לנו להבין טוב יותר את הקשר בין הפתוגנזה, הטיפול והשרידות. זאת על מנת שנוכל להבטיח טיפולים טובים יותר בעתיד. 32

Summary Oral cancer is one of the most common cancer types in the world, and in 2012 as 2.7% of cancer cases worldwide were of this type. In the same year, as 1% of cancer cases worldwide were located at the oropharynx or the laryngopharynx. Most cancer cases that develop in the mouth or the oropharynx are classified as Squamous cell carcinoma. It has been known for a long time that tumors of those kinds are relates to risk factors as tobacco and alcohol consumption, but researches that were lately conducted in western countries revealed that Human Papillomavirus presence was discovered in many of those tumors (up to 85%). Furthermore, it was found that patients who are positive for the virus, tend to have a younger age, a better prognosis and less tobacco and alcohol consumption in their history, comparing to patients who are negative for the virus. The aims of this research were identification and classification of Human Papillomavirus types which are involved at malignant Squamous cell carcinoma tumors at the base of the tongue and the tonsil among patients group in Israel, and characterization of the clinical indices associated to Squamous cell carcinoma which is positive for the virus. This research is a part of a multicenter national study that included five hospitals. In the research that was carried out in "Hadassah", we conducted a search in the medical center's Database after patients that had a biopsy or an excision surgery of a Squamous cell carcinoma tumor from the base of the tongue or the tonsil. The suitable patients for the research were those who's samples were available in the pathological archive and fitting for the laboratory tests that were conducted, and that their medical files are available for the data collection. For each sample, an HPV Genotyping test and an immunohistochemical staining for P16 protein were performed. 13 patients were included in the "Hadassah" research group and 74 were included in the general one. In the "Hadassah" research, one sample was from the tonsil and the rest were from the base of the tongue, and in the general research 72% were from the base of the tongue. According to the data that was collected, as one third of the samples was found to be positive 31

for the presence of Human Papillomavirus. It was found that HPV16 is the most common type in the research group. Additionally, it was discovered that patients who's tumors are positive for the virus tend to be younger and not to have cigarettes smoking at their past. One of the interesting findings of our research was that the percentage of the Papillomavirus presence among patients from the Arab population was similar to the one among the patients from the Jewish population in the research group. In light of the above, it seems possible to consider performing an HPV Genotyping assay as a routine test for young patients who did not have smoking habits in their history, but do have an oral or oropharyngeal Squamous cell carcinoma tumor. This considering the many evidences existing at the literature regarding the better prognosis of tumors which are positive for the virus, and their better response for radiation treatments, in comparison to tumors which are negative for the virus. Further studies are required regarding this subject. In my opinion, it is appropriate that these will be prospective studies, which include larger numbers of patients and allow us a better understanding of the relation between the pathogenesis, the treatment and the survival. This in order to provide a better treatment in the future. 32

רשימת ספרות - Ang KK, Harris J, Wheeler R et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N Engl J Med 2010; 363:24-35. - Bosch FX, Lorincz A, Muñoz N, Meijer CJLM, Shah KV. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol 2002;55:244 65. - Bouvard V, Baan R, Straif K, Grosse Y, Secretan B, El GF, et al.: A review of human carcinogens Part B: biological agents. Lancet Oncol 2009; 10:321-322. - Chaturvedi AK, Engels EA, Anderson WF, Gillison ML. Incidence Trends for Human Papillomavirus Related and Unrelated Oral Squamous Cell Carcinomas in the United States. J Clin Oncol 2008; 26:612-619. - Clifford GM, Gallus S, Herrero R et al. Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV prevalence surveys: a pooled analysis. Lancet 2005; 366:991-998. - Curado MP, Boyle P. Epidemiology of head and neck squamous cell carcinoma not related to tobacco or alcohol. Curr Opin Oncol 2013; 25:229-234. - de Martel C, Ferlay J, Franceschi S, Vignat J, Bray F, Forman D, et al. Global burden of cancers attributable to infections in 2008: a review and synthetic analysis. Lancet Oncol. 2012; 13:607-615. - D'Souza G, Kreimer AR, Viscidi R, Pawlita M, Fakhry C, Koch WM, et al. Case-control study of human papillomavirus and oropharyngeal cancer. N Engl J Med 2007; 356:1944-1956. - D Souza G, Agrawal Y, Halpern J, Bodison S, Gillison ML. Oral sexual behaviors associated with prevalent oral human papillomavirus infection. J Infect Dis 2009; 199:1263-9. - Dunne EF, Unger ER, Sternberg M et al. Prevalence of HPV infection among females in the United States. JAMA : the journal of the American Medical Association 2007; 297:813-819. 33

- Fakhry C, Westra WH, Li S, Cmelak A, Ridge JA, Pinto H et al. Improved survival of patients with human papillomavirus-positive head and neck squamous cell carcinoma in a prospective clinical trial. J Natl Cancer Inst 2008; 100:261-269. - Feller L, Lemmer J. Oral Squamous Cell Carcinoma: Epidemiology, Clinical Presentation and Treatment. JCT, 2012; 3, 263-268. - Franceschi S, Munoz N, Bosch XF, Snijders PJ, Walboomers JM. Human papillomavirus and cancers of the upper aerodigestive tract: a review of epidemiological and experimental evidence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1996; 5:567-575. - Gillison ML, D'Souza G, Westra W et al. Distinct risk factor profiles for human papillomavirus type 16-positive and human papillomavirus type 16-negative head and neck cancers. J Natl Cancer Inst 2008; 100:407-420. - Glezerman M, Piura B, Insler V. Cervical cancer in Jewish women. Am J Obstet Gynecol 1989; 161:1186-1190. - Gregoire V, Lefebvre JL, Licitra L, Felip E. Squamous cell carcinoma of the head and neck:ehns ESMO ESTRO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 21 (Supplement 5) 2010; v184 v186. - Grisaru D, Avidor B, Niv Jet al. Pilot study of prevalence of high-risk human papillomavirus genotypes in Israeli Jewish women referred for colposcopic examination. J Clin Microbiol 2008; 46:1602-1605. - Habbous S, Chu KP, Qiu X, Delfa AL, Harland LTG, Fdhel E, et al. The changing incidence of human papillomavirus-associated oropharyngeal cancer using multiple imputation from 2000 to 2010 at a Comprehensive Cancer Centre. Cancer Epidemiol 37 (2013) 820 829. - Herrero R, Castellsague X, Pawlita M, Lissowska J, Kee F, Balaram P, et al. Human papillomavirus and oral cancer: the International Agency for Research on Cancer multicenter study. J Natl Cancer Inst 2003; 95:1772-1783. - Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA CANCER J CLIN 2011;61:69 90. - Klug SJ, Molijn A, Schopp Bet al. Comparison of the performance of different HPV genotyping methods for detecting genital HPV types. J Med Virol 2008; 80:1264-1274. 31

- Kumaraswamy KL, Vidhya M. Human papilloma virus and oral infections: an update. J Cancer Res Ther 2011; vol. 7, no. 2, pp. 120 127. - Lassen P, Eriksen JG, Hamilton-Dutoit S, Tramm T, Alsner J, Overgaard J. Effect of HPV-associated p16ink4a expression on response to radiotherapy and survival in squamous cell carcinoma of the head and neck. J Clin Oncol. 2009; Apr 20;27(12):1992-8. - Mirghani H, Amen F, Moreau F, Guigay J, Ferchiou M, Melkane AE, et al. Human papilloma virus testing in oropharyngeal squamous cell carcinoma: What the clinician should know. Oral Oncol 2014; 50, 1 9. - Montero PH, Patel PD, Palmer FL et al. Changing trends in smoking and alcohol consumption in patients with oral cancer treated at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center from 1985 to 2009. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2012; 138:817-822. - Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, Herrero R, Castellsague X, Shah KV et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. N Engl J Med 2003; 348:518-527. - Ostrer H, Skorecki K. The population genetics of the Jewish people. Hum Gent 2013; 132:119-127. - Pagliusi DS. Vaccines against Human Papillomavirus. 18 July 2001. http://www.who.int/vaccines/en/hpvrd.shtml - Parkin DM, Bray F. Chapter 2: The burden OF HPV-related cancers. Vaccine 2006; 24 Suppl. 3: S3/11-25. - Pillai MR, Phanidhara A, Kesari AL, Nair P, Nair MK. Cellular manifestations of human papillomavirus infection in the oral mucosa. J Surg Oncol 1999; 71:10-15. - Sadan O, Schejter E, Ginath S, Bachar R, Boaz M, Menczer J, et al: Premalignant lesions of the uterine cervix in a large cohort of Israeli Jewish women. Arch Gynecol Obstet 269:188-191, 2004 - Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, Fukuda T, Nakajima T. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. Am J Pathol 1998 153:1741 1748. 35

- Schwartz SM, Daling JR, Doody DRet al. Oral cancer risk in relation to sexual history and evidence of human papillomavirus infection. J Natl Cancer Inst 1998; 90:1626-1636. - Shah KV. Do human papillomavirus infections cause oral cancer? J Natl Cancer Inst 1998; 90:1585-1586. - Smith EM, Hoffman HT, Summersgill KS, Kirchner HL, Turek LP, Haugen TH. Human papillomavirus and risk of oral cancer. Laryngoscope 1998; 108:1098-1103. - Zini A, Czerninski R, Sgan-Cohen HD. oral cancer over four decades: epidemiology, trends, histology, and survival by anatomical sites. J Oral Pathol Med 2010; 39:299-305. - American cancer society - 2211 http://www.cancer.org/cancer/oralcavityandoropharyngealcancer/detaile dguide/oral-cavity-and-oropharyngeal-cancer-survival-rates - GLOBCAN 2012 - http://globocan.iarc.fr/pages/fact_sheets_population.aspx - Israel National Cancer Registry 2006 incidence rank all invasive 2. http://www.old.health.gov.il/download/pages/2006_incidence_rank_all_i nvasive_2.pdf - Israel National Cancer Registry 2006 incidence rank all invasive 1. http://www.old.health.gov.il/download/pages/2006_incidence_rank_all_i nvasive_1.pdf - National cancer intitute - 2211 http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/oropharyngeal/patien t/page1 דוח שר הבריאות על העישון בישראל - 2211 http://www.health.gov.il/publicationsfiles/smoke2011_30052012.pdf מרכז המחקר והמידע בכנסת צריכת אלכוהול בקרב ילדים ובני נוער - 2221 https://www.knesset.gov.il/mmm/data/pdf/m02326.pdf 31