77 שינויים ביוכימיים בכדורית הדם האדומה של אדם עם הזדקנותה חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה" מוגש ע"י פרידה ברוק-סימוני למועצה המדעית של מכון ו

77 שינויים ביוכימיים בכדורית הדם האדומה של אדם עם הזדקנותה חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה" מוגש ע"י פרידה ברוק-סימוני למועצה המדעית של מכון ויצמן למדע, רחובות ן תשל א יוני 1971

שינויים ביוכימיים בכדורית הדם האדומה של אדם עם הזדקנותה חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה" מוגש ע"י פרידה ברוק-םימוני למועצה המדעית של מכון ויצמן למדע, רחובות סי ו ן תשל א יוני 1971

לזכר אמי

עבודה זו בוצעה בהדרכתם של פרופ' ב. רםות, מכון המטולוגי ב י"ח תל-השומר ע "ש ס י בא, וביים לרפואה של אוניבםיסת תל-אביב, פרופ * ד. דנון, המחלקה לאולטרא- סטרוקטורה ביולוגית, מכון ויצמן למדע.

תודתי נתונה לפרופ * ב. רמות ופוופ ד^. דב ו ך על הדרכתם הנאמנה. לגבי* פ. הולצמן על בצוע העבודה הטכנית וכץ מובעת תודתי לחברי במכו ן ההמט ול ו ג י בי ח תל השוםר ע ש שיבא ובמחלקה לאולטראסטרוקטורה ביולוגית, מכון ויצמ על הסיוע הרב שקבלתי מהם.

תוכן הענינים מבוא 1 עמוד המעגל הגליקוליטי 2 מעגל הפנםזות 4 חומרים ושיטות 10 הפרדת תאים לפי הגיל 10 1. פעילות תםסית 11 חומר ים 13 2. מאגר הנוקלאוטידים 14.3 גליקוליזה 16 3,2.4 דיפוםפוגליצראט 17 5. פעילות אדנוזין טריפוםפאטאז 18 6. מלחי נתרן אשלגן 18 7. גלוטתיון מחוזר 19 8. שבירות אוםמוסית 19 9. התפלגות הת&ים לפי,'םשקלם> הסגולי 19 חומר קליני 19 19 תלםמיה.1 19 היפוכרומית אנמיה 2. 3. אנמיה רפרקסורית םידרובלסטית 20.4 מיאלופיברוזים 20 5. מחלות הקשורות בהרס מוגבר של התאים האדומים 20 תוצאות 22 אדם של אריטרוזניסים להפרדת השיטה בדיקת 22 מבדלת בהצפה 24 תםםית פעילות 30 סריפוםפאטאז אדנוזין 30 הנוקלאוטידים מאגר 30 גליקוליזה 32 והנתדן האשלגן רמת 32 דיפוםפוגליזנדאס 3,2 33 מחוזר גלוסתיון 34 אוםסוטית שבירות

תוכן ענינים עמוד '34 34 41 43 45 47 56 58 חומר קליני המוליטיות אנםיות םידרובלםסית דפרקטורית אנמיה גרזל חוסר של ואנמיה תלסמיה מיאלוברוסיג! דיון סכום ספרות סכום אנגלי

רע יפת פנלאות עפו ד f 1 1 0 H K י ט ו ת טבלח עונות טפ si לקביעת&בין 1 erbbit 1 6 ) ט בלוז טפי* 8} פעילות זזדנו? 1 ין ט 1 יפופפטן גמ&וליזטיט 18 טנל» פט* 3: ויייואיןטיניות בטקטעיט סחופרדו גרפיט שםומנו גבר?ל S Pe869 טבלה פט 4! משואח ג י ז p&imchc המות חרט * Pו- לו*יטיט נתאיט טדפודיט 84 טבלוז מם 5! טבלת פט 0! טפ טבלח טפ 8: טגלמ טגל 1 ו פט id טריפופטט אדנוזין תפפיפ זדפת פעילות 84 שונות גחטדדות 86 גליקוליטייט תטטיט פעילות?"8 נוטפיפ גלי«ןוליטיע תטםיט פעילות גלוקוניק 6 «טו&פט גלו?ו«פעילות אוטית אוקטלו וגלוטאמית 1 מי 11 וגנו!טיאנפאפינא S8 1 וי»ט גי ן ז 8*«1 *עיףיפ ו^ןניפ ונין תאיפ ויןניפ 1Va01*1«ft 89 ללית b*f tt«a13 1(1*t» פעילות תטפי-ת פט 10 ו מעו 1 א» *ין טנלח 89 פופדריפ נפקטעיפ 1 טיקולוציפיפ 31 של^^קז^לליות פט! 11 פעילות טבל!{ DPG, AMP, ADP, ATP 31 טפ 2,3 18 ט&ל» 38»גיל פופרדיפ לפי נתאיפ נלי?ולי* 1. פט! 18 ט 3 לח טבלון פפ! 14 בטויי גו 1 ין ואעלגין נתאיפ טופרויט 83 טבלח פפ IS ו כפות גלוטתיון פ»וז 1 בתאיט פופוידיפ 88 הויטייןולו- ונפות פעילות : תספיתי.. פפ : 16 טבלו* 36 נד 3?זות הפוליטיות *אגפיות *יטיפ ת 1 טייןולוציטיפ ונפות תפפית פעילות פפ : 19 טבלח 36 קונגנטיליות מפוליטיות באנפיות פופדייט ו*פייק 1 לו*יטי גת.איפ פיזוד פפ : 18 מ»ולי 0 י ו» נאנפיות לפי» 1 יל וןו טיקולווגיפיפ ונפות תפפית פעילות פפ : 19 טבלח 38 א 1 לוטיג*ית הפוליטיות עפ נאנפיות מףפיקולוןייטיט ונפות תפטית פעילות פפ 80 טבלח 38 8313 ות, ט 1 אוטיות הפוליטיות האגפיות מרטיקולוציטיפ ונפות תטפית פעילות פפ : 21 טבלו? PD639 G מוטף הפוליטיות עט נאנפיות עפ נדיאיפ נאנשיפ תפפית פעילות פפ : 88 טבלו; PD640 G חיטי טדיפוס- איניזין תפפית, פעילות פפ 88 טבלו? נאנפי 1 { חרפיקולו*יטי 0 פאט וכפות 41 דפףקטוףית 6 -פופפאט נלויןו! תפפית סל פעילות פפ 84 פנל ל.»אינו*ין ולפת וחיןפוקינא* &4 נטלפפי!? טףיפופפאט

V טבלה םםי י 25: פעילות תםםית סל גלוקרז 6 -פוםפאט דהידרוגנאז ורפת האדנוזיץ טרי פוםפאט באנמיה בגלל חוסר ברזל 45 טבלה מס * 26: פעילות תססית, רמת אדנוזין טריפוםפאט וכמות רטיקולוגיטים במיאלופיברוםיס 46 טבלה מם, * 27: ירידה בפעילות תסםית ו ATPבתאים זקנים לעומת אוכלוסית תאים חסרת דטיקולוציטים המבוטאת כ- 100$ 46 *י *

מילון תסס י ם Enzymes ATPaie טוספאטאז 5 טדי א ד נ ו ז י ן איזוניסדית דחידרוגנאז ICDH EN אנולאז AChE אםסדאז פולין אגטיל GOT טואנםאטינאז אוקםלואצטית גלוטםית G6PD דחידדוגנאז 6 פוסטאט ג ל וp ד ז GAPDH דהידדוגנאז גליזנדאלדהיד 3 פוםפאט GDH דהידדוגנאז 1 פוטפאט גליגדול DIaphorase דיאטודאז HK הקםוקינאז TPI סר י ו ז פוספאם א י זומדא ז LDH דהידדוגנאז לקסיק 6PGD דהידדוגנאז גלוקוניק פוספו 6 PHI פופפופרוקטוקינאז - פוםפוהקסוקינאז PGI פוםפוהקסואיזוםראז PGK קיבאז פופפדגליצדאם PGM מוטאז פוםפוגליצראט PK פירובאטק י נא ז Catalase קטאלא ז קואניזימים אדנ י ן אדנו זין וסובםטרטים Coenzymes and substrates ADP דיפוםפואט 5 אדנוזיץ AMP מונופוספאט 5 זין אדנו ATP סר יפוספאט 5 אדנו ז ין 6PG 6' פוםפאט גלוקוז GAP Guanine פוםפאט 3 גליצראלדהיד גואנ י ן Glutathione reduced מחוזר גלותטיון DPG 2,3 דיפוםפוגליצראט 3,2 Hypoxanthine היפוקםנטין Pyruvic acid Lactic acid Nicotinic acid Triosphosphate פירובית לקט ית ניקוטינית פוםפאט חומצה חומצה חומצה טריוז NAD-DPN 3 וקלן!וטיד די אדני ן אמיד ניקוטין NADH-DPNH דו נוקלאדסייד, טחו זר אדנין אמיד ניקוטין NADP-TPN פוםפאט נוקלאוטיד די אדנין אמיד ניקוטין מחוזר פוספאט נוקלאוטיד די אדנין אמיד ניקוטין NADPH-TPNH

מילון (המסך) פורין נוקלאוטיד Purine nucleotide פ יד י די ן נוקלאוטיד Pyridine nucleotide פוספאט 6 פרוקסוז P6F 1 פרוקטוז 6, דיפוספאט DP6,p פוספוגלוקונאט 6 PG6 פוםפוגליצראט 2 p2 פוםפוגליצראט 3 p3 מושגים Oubain א ו בא י ן Buffer substrate פוםפאט בופד Gravildt גרביקיט Di n butyl phtalate פטלאט די-נ-בותיל pathway) Glycolytic cycle (Embden Meyrhof גליקוליטי מעגל ץ Penthose phosphate cycle (hexose monophc^hgte פנטוזות מעגל Krebs cycle parnway^ מעגל קרבם Methyl phtalate מתיל פטלאט Normoblast נורמובלסט Neutralization י סתירה Kit ערכה Keton reagent קטון ריאגנט Pacemaker קוצב Ribosome ריבו זום Stem cell תא אב מחלות אנמיה היטוכרומית בגלל חוסר ברזל Hypo!chromic: iron deficiency anemia אנמיה המוליטית םפרוציסרית Spherocytic hemolytic anemia םפרוןיטרית הפוליטית לא אנמיה Non spherocytic hemolytic anemia רפרקסורית םידרובלםטית אנמיה מיאלופיברי ז ים Refractory sideroblastic anemia Myelofibrosis ( Thalassemia minor מינוי תלםםיה

Abbreviations AChE ADP ALD AMP ATP ATPase DHAP 1,3 DPG 2,3 DPG DPGM EMP EN E4P FDP F-6-P GAP GAPDH GDH GOT G-6-P G-6PD GSH HK HMP ICDH LDH M NAD NADH NADP NADPH NADase PEP 2- PG 3- PG Aceteylcholine esterase (3.1.1.7 acetycholine hydrolase) adenosine-5'-diphosphoric acid aldolase (4.1.2.13 fructose-l,6-diphosphate-d-glyceraldehyde-3- phosphate-lyase) monophosphorlc ' 5 adenosine acid 5'-triphosphoric adenosine acid adenoslne-5 1 -triphosphatase (3.6.1.8. ATP pyrophosphohydrolase) Dlhydroxyacetone phosphate 1,3 dlphosphbglycerate 2,3 dlphosphoglycerate dlphosphoglycerate mutase Embden Meyerhof Pathway Enolase (4.2.1.11 2-phospho-D glycerate hydrolase) Erythro y 4 phosphate fructose diphosphate fructose-6-phosphate D,L glyceraldehyde-3-phosphate glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (1.2.1.12 -D-glyceraldehyde- (phosphorylating) 3-phosphate : NAD oxireductase glycerol-! -phosphate dehydrogenase (1.1.1.8-L glycerol-3-phosphate NAD oxireductase) glutamic oxalacetic transaminase (2.6.l.l-L-aspartate:2-oxoglytarate aminotransferase) g lucose-6-phospha te phosphate 6 glucose dehydrogenase 1.1.1.49) : 6-phosphate D-glucose NADP oxidoreductase glutathione (reduced form) hexokinase (2.7.1.1-ATP: 6-phosphotrasferase D-hexose hexose monophosphate pathway isocitrate dehydrogenase (1.1.1.42 threo D s : isocitrate NADP oxireductase (decarboxylating) lactate dehydrogenase (1.1.1.27-L-lactate: NAD oxireductase) Mol nicotinamide adenin dinucleotide nicotinamide adenin dinucleotide, reduced form nicotinamide adenin dinucleotide phosphate nicotinamide adenin dinucleotide phosphate, reduced form (D'PNase) NAD nucleosidase (3.2.2.5-NAD glycohydrolase) phosphoenol pyruvate 2-phosphoglycerate 3phosphoglycerate *

6-PG 6phosphog1ucona te 6-PGD : gluconate D 6-phospho 6phosphogluconic dehydrogenase 1,1,1,44) NADP oxireductase (decarboxylating) 6-PGL 6phosphoglucolactone PHI phosphohexoseisomerase (5.3.1.9 ( isomerase ketoj phosphate 6 glucose D P? inorganic phosphate PGK phospho l glycerate D 3phospho ATP: 3-phosphoglycerate kinase (2.7.2.3 transferase) PGM. 2.7.5.3 ) Phosphoglycerase mutase / 2-2phospho : glycerate D 3diphospho D-glycerate phosphotrasferase) PK pyruvate kinase (2.7.1.40 ATP: pyruvate phosphotransferase) PRPP 5' phosphoribosyl 1-pyrophosphate RNA ribonucleic acid 59-R 5-phosphate ribose 5P Ru ribulose-5-phosphate S-7P s'edulose 7 phosphate TPI triosephdsphate isomerase (5.3.1.1. D glyceraldehyde-3-phosphate ketolisomerase) TRA Triethanolamine TRIS Tris (hydroxymethyl) aminomethane Xu-5P xylulose 5-phosphate

1 מבוא במשך שנים רבות נחקרו השינויים המופיעים גתאים אדומים (אדיטרוציטים) במחזור הדם ההיקפי, תוך הזדקנות פיזיולוגית, בהנחה שמציאת סוני במערכת המפפקת אנרגיה או במבנה התא הזקן, תםייע להבנת תהליך ההזדקנות. מוצאו סל התא האדום בתא-אב Stem cell הנמצא במרכזים הםטוטו- אסיים (1). תא זה עובר דיפרנציאציה, ולאחד מספר חלוקות הופך להיות נורמובלסט, דהיינו, תא אדום המכיל גרעין העתיד להפלם תוך התבגרותו הנופפת. הנורמובלםם מייצר כמויות גדולות סל המוגלובין בהסואה ליתר חלבוני התא (4, 2). 3, לאחר פליטת הגרעין (5) יוצא התא הנקרא רםיקולוציס למחזור הדם. תא זה מסוגל ליצר חלבונים בעזרת הריבוזוםים, ה RNA למיניהם ומערכת התפםים סעדיין נותרו בו מימי היותו בעל גרעין תוך תקופה קצרה של 72-24 סעות מאז יציאתו למחזור מתבגר הרטיקולוציס לאריטרוציט בשל. תהליך הבשלה זה מלווה באיבוד שאריות המיטוכונדריה, הריבוזוםים, החומצות הגרעיניות, הצנטדיולי ושאריות מערכת גולגיי. האריטרוציטים הבשלים, העושים דרכם במחזור הדם, נושאים בנטל כבד של מילוי תפקידים פיזיולוגיים חיוניים. תפקיד האריטרוציטים להוביל חמצן מהריאות לרקמות ודו תחמוצת הפחמן ) C02 ( מן הרקמות אל הריאות. בדרכו הארוכה עובר התא במעברים בעלי קוטר קטן משלו, משנה את צורתו וחוזר לצורתו המקורית. על מנת לעמוד בתפקיד קשה זה חייב האריטרוציט לקבל הספקה סדירה של אנרגיה, אותה הוא מקבל

מסדרת תהליכים בהם מנוצל הגלוקוז בסקור אנרגיה בלעדי (&). האנרגיה המופקת ם שריפת" גלוקוז מאפשרת לתא שלא להתכלות טרם זמנו ולמלא את תפקידיו הפיזיולוגיים תוך שמירה על צורתו, גודלו, הרכבו הכימי,שלימותו הםסרוקםורלית ומצבם הפחוזר של ההמוגלובין דחלבוני התא האחרים. הגלוקוז חודר לתא האדום בדיפוזיה (8, 7). עם כניסתו לתא פועל עליו התםס הראשון של המעגל הגליקוליטי - ההקסוקינאז - הגורם וםפורילציה של הגלוקוז והופכו לגלוקוז G6 פוםפאט - 6. P תסס זה קובע את שעור הניצול של הגלוקוז במעגל הגליקוליםי ומשום כך ראה Rapoport^ את ה קוצב" pacemaker של תהליכי הגליקוליזה האנארובית (9). הגלוקוז- 6 -פוםפאט מנוצל בשתי דרכים: כ- 90$ במעגל הגליקוליסי והיתר ע י מעגל הפנטוזות (10). המעגל הגליקוליטי הגלוקוז המנוצל דרך המעגל הגליקוליטי מתפרק וממנו נוצרות שתי מולקולות של חומצה לקסית (ראה ציור מם יי 1). הגלוקו ז- 6 -פוםפאט הופך להיות פרוקטו ז - פ ו ס פ א ס P6F6- ולאחר מכן לפרוקסוז דיפוספאס - FDP ע י פעולה של תסס פוםפופרוקםוקינאז - PF}>. בתום שלב זה פועל התםם אלדולאז - ALd המפצל את ההקםוז לשתי מולקולות של טריוז פוםפאס. אם נעריך בשלב *ה את המאזן האנרגטי, נווכח שיהיה צורך להשקיע שתי מולקולות אדנוזין טריפוםפאם * ATP על כל מוקלולה של גלוקוז שנכנסה למעגל הגליקוליטי והגיעה לנקודה זו. אולם מכאן ואילך, תוך םםבוליזם של טריוז פוספאסים במעגל הגליקוליםי, חלה הצטברות של אדנוזים טרי-

1 GLUCOSE <ZiE -*HMP Shunt 6R3P k DHAP GBPDH DP&H ADPA pen ע RTP\ J 2,3 DP0 PEP ) PH ATP, PyRUVfiTE צניור מס \ הנ וגעל הגליקוליס

פוםפאט. הפיכת הגליצראלדהיד פוםפאט - GAP לחומצה פוםפוגליצרית - PGA והפיכת הפוםפואנול פירובאט PEP ללקטאט יוצרים 4 מולקולות של אדנוזין סריפוספאט, בסיומו סל המעגל מראה מאזן האנרגיה תוםפת של שתי מולקולות של.(IT) "ATP אנרגית האדנוזין סריפוםפאט משמשת לתא האדום כצבד אנרגיה המנוצל על ידי התא לביצוע תהליכים הדורשים אנרגיה. שמירת הריכוזים הנכונים של קטיונים בתא הינו אחד התהליכים החשובים הצורכים אנרגיה (12-19). מניעת מפל ריכוזים מחייבת העברה מתמדת של קטיונים משני עברי הקרום. האנרגיה הדרושה לתהליך זה מתקבלת ע י פירוק קשרים עתירי אנרגיה של אדנוזין טריפוספאס בעזרת מערכת תסםים הקרויה אדנוזין טריפוםפאטאז - ATPase הנמצאת בקרום התא ומופעלת על ידי הקטיונים: נתרן, אשלגן ומגנזיום ומעוכבת ע יי אובאין - Oubain (20-24). תכונותיה של מערכת זו אינן ברורות די צרכן, ומשמשות נושא לויכוח בין העוסקים בחקירתה (25-28). האדנוזין טריפוספאט מנוצל גם לביוסינתזה של פורין נוקלאוםידים מאדנין כחומר מוצא (29). כידוע אין התא האדום חסר הגרעין מסוגל לםנתז פורין נוקלאוטידים (30). את צרכיו בחומרים אלה מקבל התא האדום םהרקמות האחרות באופן בלתי מושלם. הן מסופקות לו בצורת אדנין, גואנין והיפוקסנטין ועוברים אינקורפורציה לתוך הנוקלאוטידים של התא האדום (29-32). הסינתזה של פורין נוקלאוםידים עוברת דרך phosphoribosyl-l-pyrophosphate-5-prppומזורזת ע י פוספאט אנאורגני )32, 33( בתהליכי אינקורפורציה וסינתזה אלו משתתף ה~. ATP

גם יצירת הפירידין נוקלאוסידים דורשת םהתא השקעת אנרגיה, אותה הוא שואב ממצבורי אדנוזין טריפוםפאט (34). הפירידין נוקלאוטידים חיוניים לתקינות המעגל הגליקוליטי ומעגל הפנטוזות בו הם משתתפים וכן עקב היותם חומרים מחזרים הממלאים תפקיד בשמירת חלבוני התא במצב מחוזר (35). ואכן התא חייב לדאוג לשמירת הרמות המתאימות של קואנזיםים חשובים אלה וזאת הוא עושה ע י חיבור חומצה ניקוטינית עם ריבוז פוספאט -,P5R תוך ניצול אדנוזין טריפוספאם, 37(36). האריטדוציט משחלף בהתמדה כולסטרול (38), פוספוליפידים (40, 39) וחומצות שומניות (41, 40) בין הפלסמה ובין קרום התא, תוך ניצול אדנוזין טריפוםפאס. המעגל הגליקוליטי, נוסף לתפקידו כספק אנרגיה, הינו מקור בעל חשיבות רבה לתרכובות מחזרות - ניקוטינאםיד אדנין דינוקלאוטיד - red..nad קבוצות מחזרות אלה מאפשרות לתא להתגונן בפני חימצון יתר ולשמור על ההמוגלובין במצב מחוזר. החיזור המתמיד של הםתהמוגלובין לתפוגלובי מחוזר נעשה ע י דיאפורז,(Diaphorase(43-45- הזקוק לפעילותו לתרכובות מחזרות המסופקות לו ע י המעגל הגליקוליטי וע יי מעגל הפנטוזות. מעגל הפנמוזות עקב חשיבותו של מעגל מטבולי זה ביצירת הקואנזים ניקוטינאמיד ארנין דינוקלאוטידפוםפאט, NADH אשר שומר על גלוטתיון במצב מחוזר -46-48) H ( G S ואולי בעל חשיבות בחיזור המתהמוגלובין להמוגלובין מחוזר (49-52).

שלב ראשון במעגל הפנטוזות הוא תהליך אוקסידטיבי ההופך גלוקוז 6 פוספאם ל-! 6 פוםפוגלוקו נאט - PG6 בעזרת התםס גלוקוז 6 פוםפאט דהידרוגנאז - G6PD. יתר השלבים במעגל זה הינם שלבי פירוק לא אוקסידטיבי של הקסוז (ציור מסי 2). מאחר והמעגל הגליקוליטי וגם מעגל הפנטוזות ניזונים מגלוקוז, ברור שקיימת ביניהם תחרות על ניצולו. מידת ניצול הגלוקז במעגל זה או אחר נקבעת ע י ה- ph והפוספאט האנאורגני התוך-תאי (53-55). ph 7.6 מסיט את שווי המשקל לכוון ניצול הגלוקוז במעגל הפנטוזות (53). עלית ה- ph עד 8.2 מפנה את רוב הגלוקוז התאי לניצול בדרך הגליקוליטית. בתנאים פיזיולוגיים כמעט אין האריטרוציט נהרס במחזור הדם. באופן נורמלי אין למצוא סימנים המעידים על המוליזה בכלי הדם (56). לעומת זאת קיימות עדויות ברורות המצביעות על הוצאתו של התא מהמחזור ע י עכוב ואח כ פגוציטוזיס ע י מקרופגים או היםטיוציםים במערכת הרטיקולואנדוטלילית (57-59). תפקידו של הטחול בהוצאתם של תאים אדומים מהמחזור נחקר ע י מספר חוקרים אשר עקבו אחרי תאים מסומנים באיזוםופים (60-63). תאים אלה מתרכזים בטחול, במיוחד אלה שניזוקו לפני הזרקתם. לאחר כריתת טחול עובר תפקיד סילוק האריטרוציטים הזקנים או הניזוקים למרכיבים אחרים של המערכת הרטיקולואנדוטלילית.(64-66) לא ניתן לקבוע בוודאות אם הספק אנרגטי ירוד הינו תופעת לוואי להזדקנות או שהוא אחראי ישירות לשינויים המוכרים ע י התא הפגוציטרי

GLUCOSE HK GGP ^ CMP f6p GfiBP *ליח מס 2 מעגל jmraan

לעומת זאת ניתן להניח כי הוא עלול להספיע על סימור מבנה התא. מאמציהם סל חוקרים רבים התרכזו בבדיקות הש י נ ו י ים הביופ. י ז יקל י ים מחד, ובזיהוי השינויים הביוכימיים מאידך (67-69). הבדיקות הביוכימיות לימדונו על השינוי ים החלים בהרכב הליפידים של קרום התא, מצב ההמוגלובין, כמות האלקטרוליסים בתא והשינויים בפעילות התםםים למיניהם. מתוך העבודות הדנות על השינויים הביו- פיזיקליים ניתן ללמוד על השינויים החלים בתאים עם הזדקנותם (69). נמצא שתאים זקנים נעשו נוחים פחות לעוות צורה וחזרה לצורתם הקודמת (70, 64). 65, תופעה זו נצפתה גם בתאים ש התקלקלוי בתנאי אחסון והדגרה ונעשו יזקנים, באופן מלאכותי (65, 66). עליה משמעותית במשקלם הסגולי של התאים הזקנים ושבירותם בתמיסות היפוםוניות גברה - עובדות המצביעות על שינויים במבנה הויםקו-אלםטי של קרום התא (72, 71) כן נמצא כי המטען החשמלי על שטח פני התא המזדקן ירוד מזה שעל פני התא הצעיר (73-76) - ממצא המעיד על שינוי מבנה קרום התא. מבט ישיר על השינוי במבנה ניתן לקבל בהסתכלות במיקרוסקופ אלקטרוני בשתי שיטות שונות (77). כל גישה לחקר השינויים החלים בכדוריות האדומות עם הזדקנותן דורשת בהכרח אפשרות להפריד את התאים לקבוצות גיל כדי לאפשר השוואתן זו לזו. להפרדת תאים אדומים, בהתאם לגיל, תוך ניצול חלק מאותם / פותחו שיטות רבות (71-76). הבדלים ביופיזיקליים שהוזכרו לעיל הביקורת על מידת היעילות של ההפרדה מושתתת על עבודתו של. 1 ג< 61 חו 1 ב< 1 ^ (78), אשר הוכיח כי ברזל רדיואקטיבי חודר לאריטרוציםיאך ורק כל

עוד יוצר התא המוגלובין, דבר המאפשר סימון תאים צעירים ומעקב אחר התבגרותם. השיטות שפותחו התבססו על הבדלים במשקל הסגולי, ע י שיטת סידכוז פשוט, (79) וע י םירכוז באולטרצנטדיפוגה (80). במשך הזמן התבדר שאפשר להשיג הפרדה טובה יותר ע י הגדלת המשקל הסגולי של המדיום החיצוני כפי שנעשה ע י Prankerd באלבומין הנםיוב של בקר בריכוז של (81). 30$ יעילות גדולה יותר מתקבלת ע י שימוש במפל ריכוזים של אלבומין בקר (82-84). קיימת שיטה אחרת, המבוססת על הצפה מבדלת על פטלטים, אשר בד חשתמשו למטרות אחרות Balentine and 85) (Badford ודנון ומריקובסקי פתחו אותה לשימוש להגדרת המשקל הסגולי של תאים אדומים (86). שיטות נוספות התבססו על הבדלים בשכירות אוסםוטית של אריטרוציסים בתמיסות היפוםוניות (87-89). הבדלים במטען החשמלי אשר תוארו לראשונה ע י דנון ומריקובםקי (74) נוצלו ע י Walter להפרדת תאים צעירים וזקנים בשיטת Counter current 89).(distribution לעתים ניתן להוצא מכלל תאים קבוצות תאים בשיטות אימונולוגיות,כפי שעשו חוקרים אחדים (91-93). נעשו גם נםיונות של מעקב אחר הזדקנות תאים 94 ) ( i n vivo. לא תמיד נמצא התאמה בנםיונות להפרדת תאים בשיטות שונות, אולם ניתן לסכם, בזהירות, כי עם הזדקנות האריטרוציט חלה ירידה בכמות החומצות השומניות שבקרום התא (95), וארלי בכלל הליפידים (96, 81), בכמות האשלגן התוך-תאי ובמקביל עליה בכמות הנתרן (97).

פעילות רוב התםסים שנבדקו יורדת עם הזדקנות האריטרוציט. התםסיט שנבדקו הם: כולינאסטראז וקסלאז (93); תסטי המעגל הגליקוליטי: הקםוקינאז (99 98),, פוםפוהקם וזאי זומראז (100), פירובאם קינאז (101), טדייזפוספאט איזומראז (102), פוםפופרוקטוקינאז (103), גליצראלדהיד- פוםפאט דהידרוגנאז (104); ממעגל הפטוזות נבדקו: גלוקוז 6 פוספאט דהידרוגנאז ו- 6 פוספוגלוקוניק דהידרוגנאז (104, 99). 100, תםסים נוספים שנבדקו ונמצאו יורדים עם הזדקנות התא האדום הם: ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוסידאז -,(NADase(103 פוספסאז חומצית (105) גלוטאמית אוקסלואצטית טראנםאמינאז,(GOT(99 ואיזוציטרית דהידרוגנאז ICDH (99). לקםיק דהידרוגנאז יורד עם הזדקנות התא האדום, בדומה לתםםים אחרים, לפי חוקרים אחדים (104), ואינו יורד לפי אחרים (100). אלדולאז נמצא ע י אחד החוקרים כתםם גליקוליטי יחיד העולה במידת פעילותו עם הזדקנות התא (106). הכושר הגליקוליטי של תאים צעירים גבוה מהכושר הגליקוליטי של תאים זקנים (108, 97). 107, יחד עם הירידה בפעילות הגליקוליטית ירידה בATP - ו- (109,104, 97 3 ( D P G 2, אם כי יש החולקים על כך (110). החומרים האחרים שנבדקו ונמצאו בירידה תוך הזדקנות התא האדום הם: ניקוטינאמיד אדניץ דינוקלאוטיד -,(NAD(104 וגלוםתיון מחוזר -.(ill)gsh לגבי הגלוטתיון קיימים חילוקי דעות בספרות (112). מתהמוגלובין נבדק ונמצא גבוה יותר בתאים אדומים זקנים מאשר בצעירים ( 113-115 ).

על רקע מידע זה שאלנו את עצמנו אם ניתן לזהות גורם או גורמים העשויים להסביר את הוצאת התא הזקן מהמחזור באדם וזאת תוך חקר התאי! באדם נורמלי מחד וחקר תאי חולים, אשר אורך חיי תאיהם מוגבל, מאידך בעבודה זאת השתמשנו בשיטת ההצפה המגדלת להטרדת חאריטדוציטים בהתאם לגילם, אשד לאחר בדיקות מוקדמות נראתה כיעילה מאחרות. אמנם בעבודות הרבות שנעשו עד כה נבדקו רוב התסםים החשובים בהספקת אנרגיה באריטרוציס, אך לא היתד! אחידות בשיטת ההפרדה מחד ולא נקבעו כל התםםים מאותו מקטע של תאים מאידך. לכן קשה להסיק מסקנות על מדת חשיבותו של תסס זה או אחר למםבוליזם של התא האדום. מכיוון שלא ניתן לבצע ניסויים באדם ומכיוון שתוצאות נםיונות בעכבר או ארנבת אינן משקפות בהכרח את הנעשה באדם, השתמשנו באריטרוציםים שנלקחו מחולים במחלות דם, בהם חיי התא האדום מקוצרים מסיבות שונות בכדי ללמוד על מנגנוני ההזדקנות הפיזיולוגית של תאי דם באדם, למרות המגבלות הנובעות מכך.

- 10 - חומרים ושיטות הפרדת מא ים.לפי הגיל כדוריות דם אדומות של אדם שנלקחו בהפרין מאנסים בריאים או חולים הופרדו לקבוצות גיל על סמך משקלן הסגולי השונה בשיטת ההצפה המבדלת בתערובות של פטלט אםתרים המשמשים בתור נוזל מפריד (86). על מנת לקבל םו ללה להפרדה עורבבו מתיל פטלט ודי-נ-בוטיל פטלט ביחסים שונים כך שהתקבלה שורת תערובות הנבדלות אחת מהשניה ב- 0.004 מגי* לכל מלי*. לאחרונה נקנו תערובות מוכנות מםילם-ידע המוכר סוללה בת עשרים שמנים בשם גרביקים, עשרים קפילרות מהסוג המשמש מיקרוהםטוקריטים מולאו בשמן מתאים עד 5 ממי* גובה ולאחרי זה עם דם עד ל- 15 ממי* מקצה הקפילדה. הקפילרות נסגרו באש ועברו סירכוז. תאים בעלי משקל סגולי גבוה יותר מזה של g במשך - 5 דקות ב 1 0, 0 0 0 הנוזל המפריד עוברים אותו ושוקעים, ורק הם מופרדים מאלה הצפים על השמן המפריד, אשר משקלם הסגולי נמוך יותר (תמונה מסי* 3). לפי אותו עקרון הפרדנו כדוריות דם אדם בכמויות יותר גדולות במבחנות (116). תחילה עבדנו במבחנות בקוטר 8 ממי* ואודך 100 ממי* שעברו סיליקוניזציה ולאחרונה עברנו לעבוד עם מבחנות פוליפרופילן בקוטר 12 ממי* ואורך 100 ממי*. בשיטה זאת ניתן להפריד בין 50 עד 100 מלי* דם, ולקבל אחוז אחד בלבד מהתאים בעלי המשקל הסגולי הנמוך ביותר, אשר יקראו להלן "הקלים, ואחוז אחד מהתאים בעלי המשקל הסגולי הגבוה ביותר, אשר יקראו להלן "הכבדימ". הסירכוז נמשך כחצי שעה ב- g 5,000 (תמונה מם 4). הסתמכנו על כך שברזל עובר אינקורפורציה לתוך תאים

גרוד מס 3 אחת 3\u. מהן מכלה מול הפרדה b מעונג! קאפילוית; געל משקל סגולי יורד ודם נורמלי, ולעוזר סיוכוד. המשקל הסגולי וטיומ מתחת. לכל קאפילרה. ו PART 1.114 { 1.1101 BIO B9 B8 B7 PA.RT_2. כ c?^ףן fw? f^~^? / ^ V? ז 82 ס 1 SG. 1094 Discard jj 1090 j 1086 1062 T12 T13 T1A T15 Leucocytes 3 רוו מ 0 4 הפרדת תאים לקבוצות גיל.בשיטת. ההעעוז הנץ-בדלת, B תאים כבדים ד תאים חלים

אריםרואידים רק כל עוד הם מיצרים המוגלובין, כלומר רק תאים צעירים אשר הופיעו במחזור לאחר הזרקת הברזל. כדי להוכיח אם אמנם ניתן להפריד בשיטה זו תאי דם אדם בהתאם לגילם באותה יעילות כפי שנעשה הדבר לגבי דם ארנב, הודגרה פלזמה של 6 אנשים עם pc 5 ברזל מםוםן בצורת ציטראט הברזל. הפלזמה המסומנת הוזרקה בחזרה לכל אחד מהנבדקים. דוגמאות דם נלקחו אחרי 24 שעות והתאים האדומים הופרדו לקבוצות גיל שבכל אחת מהן נקבעה הפעילות הרדיואקטיבית. גם לאחר 7 3, ו 12 יום נלקחו דוגמאות דם אשר נבדקו בצורה דומה. במקטעים שהתקבלו, שהוכחו כמיוצגים קבוצות גיל.שונות של אריטרוציטים בדם אדם, נבדקו מספר פרמטרים: 1. פעילות תססית התאים במקטעים שהתקבלו נרחצו בםלין (תמיסת כלוריד הנתרן 0.85$) שלוש פעמים והוכן מהם הםוליזט, ע י הרחפת נפח אחד על יתאים עם::נפח אחד של כלוריד האשלגן, M 0.15 שני נפחים של טריאתנול אמין בופר, p H 0.05. M 7.5 שני נפחים של מים מזוקקים וחצי נפח של תמיסת דיגיטונין רוויה, כפי שתואר ע י 117 ).(Loder & De Gruchy ההםוליזטים עורבבו כרבע שעה ולאחר מכן עברו סירכוז כרבע שעה נוספת ב-, g 6,000 לשם קבלת חמוליזס חסר צלליות של תאים אדומים, בהמוליזטים שהתקבלו נקבעה רמת ההמוגלובין ששימש ברוב הנםויים כקנה מידה שלפיו בוטאה הפעילות התםםית של הםקםעים. מכיוון שכמות ההמוגלובין בהמוליזטים שונה ממקטע תאים אחד למשנהו, נקבעה עקומת ההמוגלובין על מנת לבחון

12 את דיוק השיטה.-., הפעילות התםסית נקבעה בעזרת Zeiss Spectrophotometer םודל PQ III ולאחרונה ב- Spectrophotometer Gilford מודל 2400 אוטומטי. הבדיקות בוצעו בתאי זכוכית (קובטות) שנפחם מלי אחד. כל חחומרים לבדיקות אנזימטיות, פרט לחומרים לקביעת טראנסאמינאז, נקנו מ Boehringer Biochemlca-Manheim ונקבעו באורך גל.340pp ההקסוקינאז נקבע בשיטה משולבת של 118) Lohr (Grignani &. פוספופר וקטוקי נא ז, 3 -פוספוגליצראט קינאז ופוספוגליצראט מוטאז בשיטות שתוארו ע י.119) al (Vogell et, פירובאטקינאז לפי (120. al (Bock et, אלדולאז לפי שיטת 121 ) ( W u & Racker, גליצראלדהיד פוםפאט דהידרוגנאז לפי.122) al (Delbruck et, לקטיק דהידרוגנאז לפי שיטת 123 ) (Kubowitz & Ott, טריוז פוםפאט איזומראז בשיטת (Beisenherz(124, פוספ והקם ו זא י ז ומרא ז בשיטת (Slein(125 0Bגלוק וז). - c k et al 6 - פ ו ס פ א ט דהידרוגנאז נקבע לפי שיטת 127 ) (Kornberg & Horecker ו- 6 -פוספוגלוקוניק דהידרוגנאז בשיטת (128 Smymlotls.(Horecker & גלוטאמית אוקםלואצטית טראנםאמינאז נקבע במודיפיקציה של שיטת ערכת BDHלקביעת סראנםאמינאז בנסיוב. התאמנו שיטה זו במעבדתנו לשימוש בתאים אדומים. נקבעה עקומת פעילות טראנסאמינאז ביחס לריכוזים עולים של המוגלובין בהמוליזט. בנסיונות אלה התברר שרק כאשר עובדים עם המוליזט אשר כמות ההמוגלובין בו קרובה לגרם אחד על כל 100 מלי* - התהליך האנזימםי נמצא בתנאים אופטימליים וההמוגלובין אינו מפריע לקריאה באותו אורך גל (!500 ( m p.

1-3 השיטה מבוססת על התהליך האנזיםטי הבא: L-aspartate + oxoglutarate. 1 י Glutamate oxaloacetate האוקסלואצסאט הנוצר בתהליך זה הופך בנוכחות אנילין לפירובאט היוצר קומפלקס צבע עם ד י -נ יטר ופנ יל-ה ידרא.ז ו ן אשר אפשר לקבוע באורכי גל בין mp:500 ל- 4 ןזז 550. בופר םובםטרט ) 2 mm חומצה גלוםארית 1 200 mm חומצה אספארטית,( M0. 1. ph 7 קטון דיאגנט ) של 4, 25 mm דיניסרו- פנילהידרזין בחומצת מלח N0.1), תמיסת הידרוק&יד הנתרן, N0.4 אנילין ציטראט וסטנדרט פידובאט. m M 2.0 לכל בדיקה משתמשים בשתי מבחנות: האחת לבדיקה והשניה לבלנק. לדוגמה, שמים 0.1 מלי* בופר סובסטדם, מוסיפים לזה 0.005 מלי המוליזט וםדגירים 60 דקות ב 37 0. במבחנת הבלנק שמים רק בופר םובסטרט ורק בסיום ההדגרה מוסיפים 0.005 מלי* של המוליזט. לכל המבחנות, כלומר דוגמה ובלנק, מוסיפים 0.1 מלי קטון ריאגנם ו 0.005 מל * של אנילין ציטראס. המבחנות עוברות הדגרה נוספת ל- 20 דקות. את תהליך יצירת הצבע מפסיקים ע י תוספת של 1 מלי של הידרוקסיד הנתרן. ממתינים ג נגד בלנק אשר הכיל את כל 5 דקות וקוראים באורך גל של ^חץ 505 המרכיבים חוץ מהמוליזס. הבלנק של אותה דוגמה. מהקריאות המתקבלות מפחיתים את קריאות מחשבים את התוצאות לפי עקומה סטנדרטית של פירובאס, המצורף למערכת הבדיקה המגיעה בערכת. BDH

14 2. מאגר הנוקלאוטידים לקביעת אדנוזיץ טריפוםפאט, נבדקו שיטות רבות בנםיון להגיע לשיטה שתהיה גם מדויקת וגם תשתמש בכמויות קטנות של דם. את השיטות הידועות אפשר לחלק למספר קבוצות: א. מודיפיקציה של שיטה כרומםוגרפית על קולונה לפי.Bartlett בשיטה זאת מעבירים דם לאחר שהושקעו בו החלבונים, דרך מחליף יונים מתאים ומוצאים את האדנוזיץ טריפוםפאט ע י מאוי ואח כ קובעים את הצפיפות האופטית ב-גןוח 260. השיטה לא היתה שימושים בשבילנו בגלל הכמויות הגדולות של דם הנדרשות לשם קבלת תוצאות מדויקות. ב. בדיקה אנזימטית םפקטרופוטומטרית: 1) בעזרת תהליך משולב עם ++ 3PG+ATP P G K + M 8 >-ADP+1,3DPG. GA PDhM PGK DPG 4 NADH ן, 3 + G A P D H > Ga 3P+NAD + P!. 2 ) _. _ ^ Hexokinase AT. וי / Glucose + ATP > G-6-P + ADP G-6-P + NADP > 6PG + NADPH + H + ג. שיטה פלואורימטרית. השיטה מבוססת על העקרון של אחת השיטות האנזימטיות, אלא שהקביעה נעשית בפלואוריפטר אשר.בו התוצאות יותר מדויקות. ד. שיטת קביעת האור הנוצר בזנבות של גחליליות לפי התהליך " 1 4 M ATP - luciferase > =» adenyl luciferase + pyrophosphate enzyme Q2 Adenyl-luclferin adenyl - oxyluclferin + +. light *

- 15 - מסוג זה היא אנרגית אור. בתהליך הנוצרת שהאנרגיה בידיעה כרומסוגדפיה על הנזכרות, פרט לשיםת כל אחת מהשיטות ניסינו עובדים עם אוכלוסיות על מנת להווכח מה הדיוק בהן, כאשר קולונה ברינגר אשר בה קובעים ערכת שיטות שנבדקו היו: מופרדים. תאים ה ט י ש - ^ PGK.GAPDH משולב עם בתהליך סריפוםפאט.(Minakami(129 ברינגר היא של מינקמי בערכת לזאת הנהוגה דומה אחרת חלבונים עובר השקעת הקודמת הוא שהתרחיף לאחר בשיטה זאת לגבי השוני סתירה. בתמיסה סריפוםפאט אדנוזין עקומת קבענו השיטות שהוזכרו בשתי חלבונים השקעת שונים לדם לפני בריכוזים ATP שהוסף מימית וגם עקומת Eppendorph פלואורימטרית בעזרת נםיונות בשימה מספר נעשו כגחליליות כפי שעשה בדקנו את יעילות השיטה כמו כן f Photofluori meter הנוצר האור נםיונות בשיטה זאת כאשר מספר נעשו 130).(Beutler Turner Photometer בעזרת לכמות ה- ATP נקבע הגחליליות בהתאם בזנבות בין השוואה. Farrand Spectrophotometer ב- השתמשנו יותר מאוחר על לקבוצות גיל ניתנת בטבלה מם, * 1. מופרדים בתאים שנבדקו השיטות במידה מדויקת ברינגר התברר לנו ששיטת ערכת סמך התוצאות שהתקבלו לשימוש השתמשנו בה לכל הבדיקות של נוחה שהיא ומכיוון מספקת ATP בעבודותינו. בעזרת ערכת נקבעו מונופוםפאט ואדנוזין דיפוםפאט אדנוזין אחד. זכוכית של מלי* בתאי מתאימה ברינגר

16 סבלה סס,, 1: השוואה בין שיטות שונות לקביעת אדנוזין סריפוםפאט. תא ים כבדים אוכלוסיה כללית תא ים קלים קיט של ברינגר 0.95 2. 80 0.50 1.00, 0.25 0.40 0.90 2. 40 0.52 1.06 0.32 0.57 גחליליות שיטה 1.00 2. 60 0.55 1.10 0.35 0. 60 פלואור יםטר ית שיטת מינקמי 0.70 1. 40 0.40 0.60 0.20 0. 30 התוצאות מבוטאות בתאים דחוסים/ jjmole/cc 3. גליקוליזה: תאים שהופרדו לקבוצות גיל עברו הרחפה בפלזמה והודגרו ב 37 - C במשך שעה, תוך טלטול, בתוספת של 200 מגי* גלוקוז על כל 100 מל * דם. נקבעה כמות הגלוקוז והלקטאם לפני ובתום ההדגרה. הלקטאט נקבע בעזרת ערכת ברינגר מתאימה אשר הותאמה לקביעת לקטאט בכמויות גדולות הנוצרות לאחר ההדגרה, וזאת בנפחים קטנים של דם. קביעת גלוקוז עוררה מספר בעיות. כל השיטות המבוססות על קביעת גלוקוז כחומר מחזר התגלו כבלתי יעילות למטרותינו. בנוכחות פטלטים הופיע חיזור לא ספציפי, ללא התאמה לכמות הגלוקוז אשר בדוגמה. השיטות אשר יעילותן נבדקה היו שיטות 131) (Somogyi, שיטת Nelson (132) וערכת ברינגר הקולורימסרית. לבסוף נבחרה השיטה המבוססת על קביעת הגלוקוז עצמו, בשיטת ערכת ברינגר אנזימסית לקביעת גלוקוז, אסר הצלחנו להתאים לבדיקות נפחים קטנים בתאי זכוכית סל 1.0-0.2 מלי.

17-2,Z 4. דיפוספוגליצראט: נקבע בשיטה אשר התאמנו לתנאי העבודה שלנו, על בסים שיטת 133) Heyden (SchrcJter &. תאור השיטה: השקעה - לשני נפחים של חומצה פרכלורית 3.5$ מוסיפים נפח.אחד של דם אשר נלקח בפרין ואשר אחוז התאים שבו נמדד. לאחר סירכוז ב- 4,000 סיבובים לדקה במסך 10 דקות, מפרידים את הנוזל העליון ומוסיפים למשקע נפח נוסף סל חומצה פרכלורית 3.5$. גם תערובת זאת עוברת םירכוז ואחרי הפרדת המשקע מחברים את שני הנוזלים העליונים. סתירה - לנפח אחד של נוזל עליון מוסיפים כשליש נפח של תמיסת סתירה ) 0.43M םריאתנולאמין-הידרוכלוריד p H 7.5 ו- 0.55M קרבונאט האשלגן) עד שמתקבל ph.התערובת 7.0 נשארת 16 דקות באמבט קרח ולאחר מכן עוברת סינון. תערובת ריאקציה ל- 10 בדיקות: ל - 10 מלי* סרים 0.005 בתוספת M p H מגנזיום כלוריד מוסיפים 6.6 מגי* של פוםפואנול פירובאס (מלח טרי- ו ציקלו הקםיל אמוניום), 2 מגי של אנולאז ו- 0.2 מגי* של פוםפוגליצראט מוטאז-. מהלך הבדיקה: ל 1 מלי* של תערובת ריאקציה מכניסים 0.005 מלי של נוזל עליון, לאחר נאומרליזציה, במהול 5^. המבחנות מודגרות 60 דקות בטמפרטורת חחדר ) 25 20C ) ולאחר מכן נקראות באורך גל ן^ז! 240 נגד בלנק המכיל 1 מל תערובת ריאקציה ו 0.005 מל של מים. למרות שבחרנו בשיטה זאת, ברור היה שמגבלתה העיקרית בכך שקנה המידה לא יציב ולכן נאלצנו לקבוע את עקום הםטנדרד בכל אחד מהנםיונות. ל- 1 מלי* של תערובת ריאקציה מוסיפים שורת דגימות ם- 0.001 עד 0.020 מלי* ~5 תמיסת M 10 של 3,2 דיפוםפוגליצראט. הצפיפות האופטית נקבעה

18 - ב- my 240 לאחר 60 דקות הדגרה ונרשמה עקומה. חישוב הדיפוםפו- גליצראט נעשה בהתאם לעקומת הסטנדרד. 5. פעילות אדנו זין סריפוספאמאז: ניסינו שתי שיטות. באחת נקבעה פעילות ה- AjVase בהםוליזםים ביחד עם קרומי התאים לפיHarwald(134 ). הוחלט לא להשתמש בשיטה זו בגלל חוסר יחם בין התוצאות שהתקבלו לרמות ההמוגלובין אשר בהמוליזםים (טבלה מם 2), וכן בגלל הפרוק הספונטני של ATP בבקורות במערכת זו. בשניה,המבוססת על קביעת ATPase בצלליות שהתקבלו בהמוליזה הדרגתית של הכדוריות האדומות לפי שיטת 135) BeuHer,(Wood & התקבלו תוצאות הנראות כםתאימות לידוע בספרות לגבי ATPase ולכן נבחרה להמשך העבודה. טבלה מסי 2: פעילות אדנוזין טריפוספאטאזי בהםוליזטים כמות פ ו ספור מיהול ההמוליזמ ריכוז המוגלובין לגרם המוגלובין 0.32 26.0 1 0.54 12.0 1/2 0.55 6.3 1/4 0.76 3.4 1/8 0.72 1.8 1/16 1.20 0.83 1/32 1.20 0;42 1/64 6. מלחי נתרן ואשלגן: התאים האדומים הופרדו מהפלםמה בםירכוז מהיר של 3 דקות במהירות של g 10,000 ב- Beckman Spinco Microfuge ומיד הופרדה הפלסמה. מהתאים הוכן המוליזט אשר בו נקבעה כמות המלחים ב- Flame,Photometer בהתאם לעקומת סטנדרד שהוכנה מראש מתמיםות של כלוריד הנתרן ו כלור י ד האשלגן.

7. גלוסתיוז מחוזר: נקבע בהמוליזטים אשר בהם לא הופרדו קרומי התאים לפי שיטת al(136. (Beutler et.. 8 ש ב י ר ו ת אוסמומית; נקבעה בעזרת פרגייליגרף מודל 2D בשיטה שתוארה ע י דנון וחבריו (137), השבירות האוםמוטית נקבעה תוך 30 דקות מזמן לקיחת הדם והיא מסומנת כזמץ אפם. כמו כץ נבדק הדם לאחר 24 שעות הדגרה,37 Go עם ובלי תוספת גלוקוז. 9. התפלגות התאים לפי משקלם הסגולי: נקבעה לפי שיטת דנוץ ומר^מזקי (86) תוך שםוש ב גרביקיט, של מילם-ידע. השוואת השינויים באוכלו סיות התאים ביץ בריאים וחולים וביץ חולה לחול נעשתח לאחר שרטוט עקום ההתפלגות. חומר קליני נבדקו הקבוצות הבאות של חולים: 1. תלסמיה - המהווה סינדרום משפחתי תורשתי אשר בו קיימת ביץ השאר הפרעה בביוםינתזה של שרשראות p, a או ץ. כמות ההמוגלובין המםונתז בתא האדום יורדת וכתוצאה מכך מופיע חסר דם המוגדר באנמיה היפוכרומית. הפגיעה בכדוריות קשורה כפי הנראה בפגם יסודי בםינתזת החלבון, אשד בתור שכזה עלול לפגוע ישירות או באופן בלתי ישיר בשליפות קרום התא. 2. אנמיה היפוכרומית - מחלה חנגרמת ע י חוסר ברזל או הפרעה בםפיגתו והעברתו לרקמות. התאים קטנים מהרגיל ו חוורים" מהרגיל ולכן קוראים למחלה זאת אנמיה ימיקרוצ יסרית היפוכרומית". בנסיוב ישנה כמות מוקטנת של ברזל. תוך טיפול בברזל מופיעה עליה בריכוז החמוגלובין

בתאים, עולה כמות הברזל בנסיוב ומופיעה צביעת גרגירי ברזל במת העצם. הסימן המשותף לאנמיה מחוסר ברזל ותלםמיה הוא עמידות האריטרו ציטים ללחצים אוםמוםיים גבוהים יחסית. 3. אנמיה רפרקסורית םידרובלסטית - במחלה זאת מופיע חוסר התאמה בין התאים הנוצרים בםח העצם ובין התאים המגיעים למחזור הדם ההיקפי. בזמן שמח העצם הינו היפרפלסטי, הדם ההיקפי דל בתאים. הליקוי הבסיס בקבוצת מחלות אלה אינו ידוע. מח העצם אצל החולים היפדפלםטי כאשר באריםדובלססים קיימת שקיעת ברזל באיזור המיטוכונדריה בצורת טבעות ring sideroblasts או בצורת גרגירים ללא סידור מיוחד. 4. מיאלופיברוזים - הינה מחלה אשר בה מח העצם פיברוםי ואינו מסוגל ליצור כדוריות אדומות. תפקיד יצור הכדוריות עובר בחלקו, המחלה מתבטאת לאיזורים אקםטרמדולרי ים כגון: כבד וטחול. כנראה, באנמיה נורמוציםית, נורמוכרומית עם הופעת תאים אדומים מגורענים ותאים םילואידיים לא בשלים בדם ההיקפי. מחלות הקשורות בהרס מוגבר של התאים האדומים - אנמיה הםולימית - 5. הפרעות ב. הפרעות מלידה. א. קבוצת מחלות זו אפשר לחלק לשנים: נרכשות. את הקבוצה הראשונה אפשר לחלק לשתי תת-קבוצות עיקריות: כיום אנמיות הפוליטיות םפרוציםריות בהן הפגיעה אינה ברורה. 1. מקובלת הדעה כי הליקוי הוא בממברנה ויתכן כי הוא נובע מחוסר אנמיות הפוליטיות לא םפרוציסריות - באריטדו- 2. אלדולאז (138). ציטים אלה נמצאו לקויים אנזימטיים באחד האנזימים הגליקוליטיים

בחלק מהמקרים, אולם ברובם לא נמצא עד היום ליקוי אנזימםי ברור. מגדירים אותם. Non Spherocytic Hemolytic Disease-o בין הליקויים האנזיםטיים השכיחים הם חוסר '. G ו 6-PD --. PK הקבוצה של אנםיות המוליסיות נרכשות יכולה להיות מצד אחד םימפםומטית למחלות שונות ובראשן מחלות קולגן ולימפומות לסוגיהן. מאידך היא יכולה להיות אידיופסית, דהיינו שאינה קשורה במחלה יסוד אחרת. באנמיה המוליטית נרכשת מופיעים בדם נוגדנים לתאי החולה עצמו. בחלק מהחולים האלה קיימת אוטואגלוםינציה של התאים האדומים אותם חולים עם אוטואגלוםינציה נבדקו וסוכמו כקבוצה נפרדת. נבדקה גם קבוצה של אנמיות הפוליטיות המופיעות לאחר טראומה. למשל, לאחר השתלת מםתםים מלאכותיים במקרי פגיעה במםתמי הלב.

- 22 - תוצאות בדיקת השיטה להפרדת אריסרוציטים של אדם בהצפה מבדלת האריטרוציטים סומנו בברזל 59 בהזרקה.בדוגםאות דם שנלקחו והופרדו לפי משקלן הסגולי (15$ מהתאים הכבדים 15$ מהתאים הקלים) נמדדה הפעילות הרדיואקטיבית של הברזל, בספירות לדקה למיליליםר של תאים. התוצאות שהתקבלו מובאות בציור מם * 5. העקומות מראות כי 24 שעות לאחר הסימון לא נמדדה רדיואקסיביות במקטע של התאים הכבדים בעוד שניתן היה לםךוד אותה בתאים הקלים. במשך 12 ימי הבדיקה לא היתה עליה מובהקת ברדיואקטיביות של התאים הכבדים. בשבוע הראשון היתה עליה ברדיואקטיביות של האוכלוסיה כולה, במיוחד במקטע של התאים הקלים. עליה זו הגיעה לשיאה ביום השביעי לאחר הזרקת הברזל, ואז החלה ירידה איטית בגלל הזרמת תאים צעירים לא מסומנים. כאשר הושוותה הפעילות הרדיואקטיבית במקטעים שהכילו 2$, 10$, ו- 40$ תאים קלים ביותר, נמצאה הפעילות הספציפית הגבוהה ביותר במקטע שהכיל 2$ (טבלה מם' 3). תוצאות אלה מוכיחות שהמימון מופיע לראשונה בשכבת התאים הקלים. היות וברזל עובר אינקורפורציה במח העצם, חייבים תאים קלים אלה להיות התאים הצעירים. קשה היה לעקוב באופן מדויק אחד התבגרות התאים והופעת הברזל המסומן באוכלוסיות כבדות יותר, כפי שנעשה הדבר בארנבת (86) מכיוון שהחולים קיבלו טיפול ובין היתר עירוי דם. למרות זאת נמצאה נדידה של האוכלוםיה המסומנת למקטעים כבדים יותר עם התבגרות התאים,

0 OtO XtV CtlLtf*}?) 0 Ter*t,P0PtH*r*oM I }OOC t * 5 * 5 6 7 S 9 to n * DAYS # r r * r t t*9*ut«i יצ 1 ר מ יס 5 הודיואקטיביות jmnip.bv גל עגל אריטווציטים המופרדים בהתאם למשקלש הסגולי, ל^וזו סימון FE 58 1- התפלגות התאים האדונזיש!אמגייס נורמליים

23 - מבלה מסי* 3: רדיואקטיביות במקטעים שהופרדו בדמים שסומנו גברזל Fe 5 9 רדיואקטיביות בהשוואה מקטע קריא ו ת/דקה/מל יי ל- 100$ לאובלומיה הכללית 2$ תאים קלים 1380 895 10$ תאים קלים 430 279 40$ תאים קלים 210 145 אוכלוסיה כללית 100 65 בדמים שהופרדו לקבוצות גיל בשימת ההצפה המבדלת נקבעו מספר פרמטרים: 1. התפלגות התאים. התוצאות מובאות בציור מסי* 6. ניתן לראות שבדםים נורמליים יש תחום צר של משקלים םגוליים שבו חל פיזור אוכלוםית התאים האדומים. ברוב המקרים נפרדים התאים הזקנים מתחת לשמן בעל משקל סגולי של 1.118-1.110 והתאים הקלים צפים מעל לשמנים בעלי משקל סגולי 1.091-1.086, כאשר רוב האוכלוםיה היא בעלת משקלסגולי של 1.102-1.098. כאשר הזדקקנו, לצורך בדיקות אחרות, לכמות תאים גדולה יותר עברנו למבחנות גדולות יותר כפי שתואר בדף 10. התפלגות התאים במבחנות היתה דומה לזו שהתקבלה בקפילרות. לפעמים חלה תזוזה קלה ב- 0.004 מגיי/מל' כאשר הסירכוז נעשה בפחות מ-. g 10,000 משמע שכל האוכלוסיה נראית כאילו פחות כבדה, כנראה בגלל העובדה, שבמהירות קטנה יותר יעברו פחות תאים את השמן. במקטעים שהתקבלו קבענו המוגלובין, המטוקריט והיחס ביניהם. כמו כן נספרו בכל מקטע הרטיקולוציםים. התוצאות מובאות בסבלה מסי 4.

24 - בתאים הרטיקולוציםים כמות השואה בין MCHC ובין מסי* 4: טבלה מופרדים ב-$ רטיקולוצ יטיס.V MCHC מקטע ס.ת. ממוצע 0 0 36.3 זקנים תאים 1$ 0.06 0.16 34.4 זקנים 2$ תאים 0.20 0. 68 33. 3 כללית אוכלוסיה 0.30 0.96 31.0 2$ תאים צע יד ים 1.00 4.12 29.2 1$ תאים צעירים פעילות תססית בחלקה הראשון של העבודה השתמשנו במקטעים שלא היו קיצוניים במידה מספקת. עבדנו אז עם 10-5$ מהתאים הזקנים ביומי ועם 10-5$ מהתאים הצעירים. התוצאות שהתקבלו מוצגות בטבלה מסי 5/ כאשר באופן כללי ניתן לראות שבתאים זקנים היתה ירידה בפעילות מספר תםםים סבלה מסי* 5: פעילות תססים ורמת אדנוזין טריפוםפאט בה 9 רדות ראשונות 5-10$ אוכלוםיה 5-10$ תאים קלים כללית כבדים תאים אנזים 2.90 2.20 1.60 G6PD 0.21 0.20 0.13 HK 4.00 2.80 2.20 6PGD 3.10 3.40 2.50 ALd 2.00 0.90 0.65 ATP פעילות תםםית מבוטאת ב- nmole/gr המוגלובין pmole/ml[pocked red cell מבוטא ב- ATP

התוצאות שהתקבלו כאשד עברנו לעבוד עם מקטעים קיצוניים יותר, כגון 2-1$ מהתאים הקלים או 2-1$ מהתאים הכבדים, מוצגות בטבלאות 7, 6, ו- 6. טבלאות 6 ו- 7 מראות את פעילות התסםים הגליקוליםיים וטבלה מסי 8 מציגה את פעילות תםסי מעגל הפנםוזות. מתוצאות אלה מתברר שחלה ירידה בכל התפסים שנבדקו כפונקציה של עלית המשקל הסגולי של התאים האדומים, כלומר כפונקציה של גילם, מאידך קיים הבדל במידת הירידה בין התסםים השונים. בטבלה מם' 9 אפשר לראות שתםם שירידתו בולטת ביותר הוא ההק&וקינאז אשר יורד החל מהתאים הצעירים ביותר, שפעילותם במקרה זה בוטאה כ- 100$, ומגיע לזקנים ביותר עד ל- 23.6$. במידה ניכרת יורדים גם גלוקוז 6 פוםפאט דהידרוגנאז, פירובאט קינאז ואלדולאז. לעומתם בולטת הירידה הקלה בלבד של גליצראלדהיד פוםפאט דהידרוגנאז ולקטיק דהידרוגנאז, הדבר מובלט בעמודות של ציור מם 7 ^אשר התוצאות מבוטאות כשינוי ם- 100$ פעילות באוכלוסיה הכללית. ההשואה בין פעילות תססית וכמות הרטיקולוציטים ניתנת בסבלה סס"* 10. Sass and Spear הציעו להשתמש בפעילות הגלוסא&ית אוקםלואצטית טראנסאםינאז - 139) T ( G O בתאים אדומים כפרמטר נוסף לאפיון גילו של התא. בטבלאות מם 8 ו- 9 ניתן לראות כיצד פעילות תסס זה יורדת עם המעבר ממקטע קל למקטע כבד יותר בכל דרגות ההפרדה. ההשואה בין GOT ובין התםםים האחרים ניתנת בציור מם 8 בו מובאות התוצאות בחישוב הלוגדיטם של כל אחד מהתסםים שנבדקו לעומת הלוגריםם של GOT

S 1 ט i i b3 a u 5 ZJ X 3 o 0 1 -ל a 21 הי 5 I P3 <2 1 11 I I ZJ כל la =3 נ= X 3 s

+ + UK log inzymei e.o *- ם o x ATP GtPD ALD o tpbd x PK FK LDH : X GAPDH + 1 x 10 05 at יד 0.5 10 t<g GOT 6s ללייור on' 8 10 n N N v m 3*^ ו ש י נ י ם ו פננינ! 1 מ אניימים ש 1, ך 6 0 במקטעים 1 ג 1 לי bjwm סגולי מיער, 1 אןבלוסית. אויסווצי^ים נורמלים. הגקודות הקעגוביוז! מעד ימין מ %\ Jinn מהתאים היצעירים jimpjn הקעיוגיחן. מ>לד שמאל מהחח_./ r מהתאים היקבים

- 26 - מגלה מס 6: פעילות תםסים גליקוליטיים תסס: LDH PK GAPDH ALd PFK HK נםיונות 12 20 10 10 14 52 מם 1$ תאים זקנים 49.0 2.9 61.0 1.5 5.3 0.13 ממוצע 13.0 1.1 11.0 0.5 2.3 0.03 ם.ת. זקנים 12$ תאים 54.0 3.4 73.0 2.4, 6.7 0.20 ממוצע 18.0 1.9 18.0 0.3 2.0 0.06 ם.ת. כללית אוכלוםיה 65.0 5.6 94.0 י 3,1 8.5 0.27 ממוצע 10.0!1.0 18.0 10.3 3.5 0.07 ם.ת. 2$ תאים צעירים ממוצע 68,0 6.1 101.0 3.5 9.0 0.33 ם.ת. 11.0 1.0 20.0 0.2 2.7 0.05 1$ תאים צעירים ממוצע 78.0 8.9 116.0 4.3 13.3 0.55 ם.ת. 17.0 1.5 24.0 0.2 5.0 0.04 פעילות תםםית מבוטאת ב- jimole/gram Hb

- 87 - סגלה מסי* 7: פעילות תסםים גליקוליסיימ נוספים תסס: PGNl PGK TPI EN 8 מם" נס י ו נות 18.1 64 498. 16.3 4.2 1 זקנים & Jתאי(* ממוצע 7.7-30.4 45-78 420-922 10.0-20.9 2.3-5.5 2$ תאים זקנים 23.2 84 653 10.0-32.0 46-115 607-1070 22.9 10.0-35.0 6.4 4.9-9.6 ממוצע טווח אוכלוםיה כללית 37.0 100 865 15.5-59.6 93-107 496-1080 28. 6 11.0-42.5 9.1 6.2-11.3 ממוצע טווח 2$ תאים צעירים 47.6 112 950 22.0-69.2 98-127 588-1271 32.8 20.0-42.5 10.9 6.7-20.2 ממוצע: סרוח 51.5 152 1309 44.4 17.8-90.1 115-228 652-1771 25.0-74.7 14.7 8.8-28.6 vp תאים צעירים ממוצע םד וח * פעילות תםםית מגוסאת כ- jamole/gr Hb

28 - טבלה מסי* 8: פעילות גלוקוז 6 פוספט גלוקוניק דהידדוגנז וגלוםאמית אוקםלו אצסית סראנםאםינז GOT P G D P D 6 6 G מסי* נםיונות 10 40 52 1$ תאים זקנים 0.9 2.1 1.3 ממוצע 0.3 0.4 0.4 ם.ת. זקנים תאים 2$ 1.0 2.2 2.0 מםוצע 0.1 1.0 0.5 ם,ת. כללית אוכלוםיה 1.8 2.7 2.5 ממוצע 0.7 0.6 0.6 ם.ת. צעירים תאים 2$ 2.5 3.4 3.2 ממוצע 0.7 0.9 0.3 ם.ת, צעירים תאים 1$ 3.1 4.4 4.3 ממוצע 0.7 1.0 0.3 ס.ת. פעילות תססית. מבוטאת ב- Hmole/gram Hb

- 29 סכלה מסי* 9: היחס בין תאים צעירים וזקנים ובין תאים זקנים ואוכלוסיה כללית באחוזים תסס תאים זקנים כ-$ תאים זקנים כ-$ מפעילות התאים הצעירים* מפעילות הא ו כל ו ם יה הכללית 48.1 23. 6 HK 62,3 40.0 PFK 48.3 35.0 ALd 64.8 52.0 GAPDH 41.0 32.6 PK 75.3 63.0 LDH 50.2 30.0 G6PD 77.7 47.0 6PGD 50.0 36.0 GOT 36.1 13.0 ATP 69.0 55.0 ADP 109.0 56.0 AMP 28.9 17.7 2,3 DPG * הפעילות של התאים הצעירים והאוכלוםיה הכללית בוםאו כ- 100$. סבלה מסי* 10: השואה בין פעילות תםםית וכמות רטיקולוציטים במקטעים מופרדים לקבוצות גיל באנשים נורמליי ם ם PGD6GOT 6PD PK HK G 10 15 10 20 20 מס נסיונות 0-10 0.64 2.0 3.5 0.22 2.0 ממוצע הפעילות התםםית 0.40 0.5 1.5 0.05 0.5 ס.ת. מבוטאת 10-20 ב- Hb fimole/gr 1.70 3.3 4.0 0.28 3.1 ממוצע 0.50 0.8 1.7 0.06 0.7 ם.ת 20-30 1.80 3.7 4.6 0.36 3.1 ממוצע 0.60 1.0 2.0 0.06 0.7 ם.ת. 30-50 2.60 4.0 5.8 0.50 3.5 ממוצע 60 נ 0 1.1 2.2 0.08 0.7 ם.ת. 50-100 2.70 4.3 7.1 0.70 3.6 ממוצע 0.60 1.0 2.5 0.08 0^8 ם.ת.

30 אדנוזין מריפוספאמאז: כפי שתארנו בפרקהסיםות נקבעה פעילותו בקרומי התאים האדומים. התוצאות שהתקבלו מובאות בטבלה מם, * 11. מתוצאות אלה ניתץ לראות שבתאים הכבדים יש מעט יותר פעילות של ATPase מאשר בתאים הקלים. אך התוצאות אינץ מובהקות. מאגר הנוקלאומידים בחרנו בשיטת ערכת ברינגר (ראה דף מם, H-) לביצוע הערכת מאגר ה-. ATP התוצאות המובאות בטבלה מם 12 מראות את כמות האדנוזיץ טריפוםפאט במקטעי התאים המופרדים. בולטת הירידה התלולה של אדנוזיץ טריפוםפאם מהתאים הקלים לתאים הכבדים, ירידה שאיץ דוגמתה באף אחד םהתםסים שנבדקו. ב- 1$ של התאים הזקנים ביותר נמצא כ- 13$ מכמות ATP^ בתאים הצעירים ביותר כאשר כמותו בהם מבוטאת כ- 100$, וכ- 36$ מכמותו בכלל האוכלוםיה (טבלה מם 9). בטבלאות מם * 9 ו- 12 ניתנות התוצאות של אדנוזיץ דיפוםפאט ואדנוזיץ םונופוםפאט בתאים מופרדים לקבוצות גיל. מתוצאות אלה נראה שקיימת ירידה קלה ביותר בשני הנוקלאוטידים האלה עם עלית המשקל הסגולי של התאים האדומים. גליקולי זה התוצאות של מספר נםיונות בהם קבענו בתאים מופרדים את ניצולת הגלוקוז ויצירת הלקטאט ניתנות בטבלה פה 13. היחס המקובל של, גלוקוז ללקטאט כ- 2:1 (141, 140) התקבל באוכלוםית התאים השלימה, אך לא בתאים הכבדים ביותר, בהם היתה כמות הגלוקוז שנוצל שווה לכמות הלקטאט שנוצרה. תופעה דומה התקבלה אף בתאים הצעירים ביותר.

- 31 - טבלה מס 11: פע ילות של ATPase בצללי ות, מם ממוצע נםיונות מקטע ם.ת. 1-5$ תאים זקנים 9.7 26.7 12 אוכלוםיה כללית 6.5 23.0 12 1-5$ תאים צעירים 8.4 23.5 12 פעילות של ATPase נ יתנה ב- mole ג * חלבון לשעה טבלה :12 כמות AMP, ADP, ATP ו-סקס 2,3 פוספט: 2,3DPG AMP ADP ATP טס נםיונות 10 6 12 26 1.1 0.5 0.067 0.010 0.11 0.06 0. 38 0.21 1$ תאים זקנים ממוצע ס.ת. 1.7 0.7 0.081 0.020 0.15 0.06 0.60 0.19 2$ תאים זקנים ממוצע ס.ת. 3.8 0.9 0.110 0.020 0.16 0.07 1.05 0.35 אוכלוסיה ממוצע ם.ת. כללית 4.1 1.2 0.110 0.020 0.16 0.06 1.58 0.70 2$ תאים צעירים ממוצע ס.ת. 6.2 1.5 0.120 0.020 0.20 0.07 2.84 1.00 1$ תאים צעירים ממוצע ם. ת. התוצאות ניתנות cells^ pmole/cc packed red

- 32 - טבלה מסי 13: גליקוליזה בתאים פופרדי ם לפי הגיל יצירת שמוש לקסם בגלוקוז מקטע 1.4 1.4 1-2$ תאים כבדים 1.95 י 1 9 כבדים 5$ תאים 3.9 2.3 כללית אוכלוםיה 5.1 3.5 5$ תאים קלים 7.3 6.4 1-2$ תאים קלים jimole/ml prc/' hour ב ניתנו התוצאות רמת האשלגן והנתרן קשה לקבוע בדיוק את כמות הנתרן בתא האדום. ריכוז הנתרן הגבוה יחסית בפלםמה ונדידתו המהירה בתנאי נםיון לתוך התא גורמים לכך שמתקבלות תוצאות שעלולות להשתנות בזמן הכנת התאים למדידה. לכן גם התיחםנו בחשדנות לתוצאות שלנו. למרות הסתיגות זו ניתן לראות בטבלה מם"* 14 שכמות הנתרן בתא הזקן עולה על זו שבתא הצעיר. מדידת ריכוז האשלגן היתה יותר מדויקת בגלל הכמות הקטנה יחסית של אשלגן בפלםמה ובגלל נדידתו האיטית יותר מהתא לפלםמה. בטבלה מם 14 ניתן לראות ירידה בולטת באשלגן תוך הזדקנות התאים האדומים. 3,2 דיפוספ,וגליצראס גם חומר עשיר אנרגיה זה יורד בריכוזו באופן בולט כאשר משווים תאים צעירים לתאים זקנים (סבלה 12). 9, מידת ירידתו ואופי הירידה דומים לאלה סל ATP כפי שנראה מסבלה מכי 9.

- 33 - סבלה מסי* 14: כפות נתרן ואשלגן בתאים מופרדים לפי הגיל מם^ אשלג ן נתר ץ מק סע.. נסי ו נות ממוצע ס.ת. ממוצע ס.ת. 1-5$ תאים זקנים 4.5 16.6 8.5 76.5 10 אוכלוםיה כללית 3.7 11.9 7.8 89.2 10 1-5$ תאים צעירים 5.2 11.6 10.7 101.7 10 התוצאות םבוםאות ב- mequi'valenl/liter cells גלוסתיון מחוזר התוצאות מובאות בסבלה סס 15 אך בגלל ריכוזים שונים של המו גלובין בכל מקטע ומקטע התוצאות שהתקבלו לא היו מובהקות. מבלה מסי* 15: כמות גלוטתיון מחוזר בתאים מופרדים לקבוצות גיל מקטע ממ וצע ם.ת. 1$ תאים זקנים 0.7 1.5 2$ תאים זקנים 0.9 1.8 אוכלוסיה כללית 0.9 1.8 2$ תאים צעירים 1.0 2.2 1$ תאים צעירים 1.0 2.3 התוצאות ניתנו ב ymole/gr Hb

34 - שגירות אוממוסית תאים שעברו הפרדה לקבוצות גיל נפגעו בדרגות שונות בזמן ההפרדה והעברתם על פםלטים, ולכן לא אפשרו התוצאות שנתקבלו הסקת מסקנות. בכל אופן, כאשר נעשתה בדיקת השבירות האוסםוטית של אוכלוםית תאים מיד לאחר לקיחת הדם בלטה בעובדה שבמידה ויש בדם עליה בכמות התאים הצעירים התבטא הדבר בעקום השבירות האוםמוטית בצורת הופעת תאים עמידים יותר (ציור מס 9 ר- 10 ). חומר קליני אנמיות הםולימיות החולים בקבוצה זאת חולקו לאנמיות המוליטיות נרכשות ותורשתיות. סיכום תוצאות הבדיקות של הפעילות התםסית בתאי דם שהופרדו לקבוצות גיל מובא בסבלאות מם 16 ו 17. ניתן לראותשבאנמיות המוליטיות נרכשות ותורשתיות אוכלוםית התאים האדומים בכללה הנה בעלת משקל סגולי נמוך יותר; כפי סהדבר מתבטא מקים רי DDC (ציוד מם' 11), כלומר האוכלוםיה צעירה יותר. מסתבר שהיא גם בעלת פעילות תסםית גבוהה יותר. כאשר משווים את אחוז הרסיקולוציסים לפעילות תםםית (סבלה מם 18) נראית הקבלה יפה ביניהם. ממצא זה מעיד שהפעילות התםסית הגבוהה נובעת מנוכחות אוכלוסית תאים צעירה המוזרמת מםח העצם לדם ההיקפי. המצב שונה לגבי אנמיות המוליטיות עם אוטואגלוטינציה. אוכלוםית התאים במחלה זאת קשה להפרדה בגלל אגרגםים של תאים הנוצרים עקב האגלוטינציה (ציור מם 12). הפעילות התםםית בתאים אלה גבוהה

*ציור מס, 9 77m* in fminuu) שגירוי.אוסמוטית של דמיו! טריינו נורמליים טי-גירגת > 3 ליור מס 10 אוסמוטית. ןץלד 0 0 ירי גחולים גנ 0 רטיקולועיטוויס.

shtcijic jmir'i י * 3 יוו מסי H הובפלגווג ה^אי 0 האדומים בחולים 3 גס אמזיה המוליסטב 3 יור מס התפלגות. התאים האדומים.באנמיה המו^יטיוע עם אוטואגלוטזנגציה

- 35 - מאד, ללא הסוואה לכמות הרטיקולוציטים הנמצאת באותה אוכלוםית תאים, דבר המעיד על סחרור תאים מםח העצם לפני זמנם, בדומה למגב שהוגדר כ- 142) erythropoesis (Stress בדיקת דמם של מספר חולים במחלה זו נתנה את התוצאות המובאות בטבלה מסי 19. סבלה פסי 16: פעילות תםםית וכמות הרסיקולוציםים באנמיות המוליטיות נרכשות (14). Retico ** תסס: locyte GOT 6PGD PK HK G6PD 14 14 14 14 מס 4/ נס יונות 3.2 1.1 0,95 0.5 3.0 0.28 3.9 1.2 0.16 0.14 זקנים 1$ תאים 1.6 ממוצע 0.6 ס,ת. 5.0 2.0 1.1 0.7 3.7 1.2 5.4 1.8 0.25 0.22 זקנים 2$ תאים 2.1 ממוצע 0.9 ם.ת. 10.0 2.5 2.0 0.9 4.0 1.3 5.8 1.8 0.40 0.16 כללית אוכלוסיה 3.2 ממוצע 1.1 ם. ת.- 16.6 4.5 4.0 2.0 4.6 1.3 6.9 2,0 0.77 0.50 צעירים 2$ תאים 3.7 ממוצע 1.5 ם.ת. 38.2 12.1 5.5 2.2 8.1 3.9 7,8 2.5 1.60 1.00 צעירים 1$ תאים 6.2 ממוצע 2.6. ם.ת. * פעילות תםםית מבוטאת ב- pmole/gr Hb ** ספירת רטיקולוצימים ניתנת ב-$

- 36 - הםוליטיות באנםיות הרטיקולוציטים וכמות פעילות תםםית מבלה מסי, 17: קונגניטליות ** דסיקולוצ יסים GOT 6PGD PK HK G6PD תסס*: 1,3 1.3 2.5 1.5 4,8 1.2 6.1 1.4 0.41 0.17 3.4 1.1 ifo תאים ממצוע ס.ת. זקנים 2.3 2.3 3.3 1.7 5.2 1.4 7,4 2.1 0.56 0.16 3.9 1.2 2$ תאים זקנים ממו גע ם.ת. 5.2 3.7 3.8 0.9 5.7 2.5 9.6 3.9 0.81 0.40 5.1 2.5 אוכלוםיה ממוצע ם.ת. כללית 10.4 8.0 5.6 1.5 5.9 2.6 16.8 3.3 1.27 0. 60 8.6 3.5 2$ תאים צעירים ממוצע ם. ת. 21.4 12.0 7.7 2.0 9.6 3.2 22.8 4.4 2.20 0. 60 10.3 3.7 1$ תאים צעירים ממוצע ם.ת. jjmole/gr H b 5 ** ספירת רטיקולוציםים ניתנת ב-$

- 37 - סבלה מס 18: פיזור רטיקולוציסים בתאים מופרדים לפי הגיל באנמיות המוליסיות (ב-$ ( ATP GOT PK 6PGD HK G6PD תסס מם נםיונות 10 10 10 15 15 15 0.78 2.0 5.3 2.6 0.24 2.5 0.21 0.56 0,8 0.6 0.08 0.6 1.37 2.1 6.2 3.9 0.31 3.6 0.74 0.68 2.4 0.8 0.09 0.8 1.41 2.3 7.0 4.9 0.40 3.7 0.21 0;47 3.1 1.0 0.12 1.0 0-10 ממוצע ם.ת. 10-20 ממוצע ם.ת. 20-50 ממוצע ס.ת. 1.55 0.87 3.1 1.7 8.1 5.1 0.65 3.2 2.9 1,5 0.10 1.5 50-100 ממוצע ס,ת. 2.02 4.0 10.5 7.0 0.85 4.8 0.44 2.4 4.4 2.8 0.26 2.4 2.70 5.6 13.2 7.2 0.95 4.9 1.45 1.85 5.1 3.6 0.27 1.5 3.30 6.1 14.5 7.9 1.00 7.8 1.40 0.9 7.0 1.0 0.70 2.5 4.4 7.0 15.7 9.0 1.65 8.2 1.6 1.7 6.6 1.4 0.47 1.8 100-200 ממוצע ם. ת. 200-300 ממוצע ם.ת. 300-500 ממ וצע ם. ת. 500 ממוצע ס.ת. * פעילות תםסית מבוטאת ב- pmole/gr Hb ** כמות ATP ניתנת ב- cells pmole/ml pabked red

- 38 - מבלה מסי* 19: פעילות תססית וכמות הרטיקולוציסים באנםיות הפוליטיות עם אגלוטינציה ** * רטיקולוצ יטים HK G6PD תסס : 6 6 6 נסיונות מסי* זקנים 1$ תאים 3.3 0.21 1.7 ממוצע 3.2 0.10 1.1 ם.ת. זקנים 2$ תאים 4.5 0. 47 3.0 ממוצע 3.5 0.17 0.5 ס.ת. כללית אוכלוסין, 8.8 0.50 4.2 ממוצע 4.6 0.18 0.9 ם.ת. צעירים 2$ תאים 21.0 0.65 4.5 ממוצע 7.7 0.17 0.9 ם.ת. צעירים 1$ תאים 34.5 2.50 3.5 ממוצע 12.5 1.20 11.2 ם.ת. סבלה מסי* 20: פעילות תםםית באנמיות המוליטיות נרכשות טראומית * HK G6PD תסס : זקנים 1$ תאים 0.12 1.6 ממוצע 0.12 0.5 ם.ת זקנים 2$ תאים 0.17 1.9 ממוצע 0.13 0.4 ם.ת. כללית אוכלוםיה 0.55 2.6 ממוצע 0.35 0.4 ס.ת. צעירים 2$ תאים 0.66 3.2 ממוצע 0. 34 0.6 ם.ת. צעירים lfo תאים 1.15 3.8 ממוצע 0.42 1.0 ס.ת. ymole/gr Hb ב תםסית מבוטאת *פעילות ב-$ ניתנת הרםיקולוצ יטים **כמות

39 במספר מקרים של אנמיות שלאחר סראומה כגון ניתוח לב פתוח, למרות שקיימת המוליזה קלח במחזור, התקבלו הפרדות תאים זהות לנורמליות גם מבחינת המשקל הסגולי (ציור סם 13), הפעילות התםסית ומספד הרםיקנלוציםים שלא עלה על תחום הנורמה. התוצאות מבוטאות בסבלה מס 20. סבלה מס 21: פעילות תםםית באנמיות! PD ל י סי ו ת עם חוסר G6 המו תסס: PK HK G6PD זקנים תאים 1$ 5.7 0.21 0.26 ממוצע 0.8 0.16 0.20 ם.ת. זקנים תאים 2$ 7.4 0. 36 0.32 ממוצע 1.6 0.17 0.23 ס.ת. כללית אוכלוםיה 11.7 0.55 0.72 ממו צע 4.2 0.32 0.31 ם.ת, צעירים תאים 2$ 17.2 0.99 0.86 ממוצע 7.8 0.60 0.47 ם.ת. צעירים תאים 1$ 30. 6 1.43 1.14 ממוצע 17.0 0.97 0. 65 ם.ת. * פעילות תםםית מבוםאת ב- jmo!e/gr Hb

ציור מס > 12 התפלגות. התאים האדווזיש.באנמיווג עקב טראומה $ *.* 11 It tt ft I t * *3 * «* 3 <צמר מסי 44 התבלגות התאים האדומים גאנמיווב ופוקטוריזוב

40 קבוצה נפרדת היוו אנמיות המוליםיות עם חוסר ( 6PDסבלה G מס 22) אשד בהם בלסה העליה בכל אחד מהתסםים בדומה לאנמיות הפוליטיות שהיה נמוך בכל ה מ ק ט ע י ם P D ת ו צ א ו ת אלה מובלטות כאשר משווים אומץ עם תוצאות המתקבלות באנשים חסרי G6PD שאינם במצב של תמס דם (סבלה מם - * 23). 22* סבלה מ ס י : פעילות תסםית באנשים בריאים עם חוסר PD6G תסס HK G6PD זקנים תאים 1$ 0.080 0.85 ממוצע 0.080 0.01 ם.ת. זקנים תאים 2$ 0.230 0.130 ממוצע 0.200 0.020 ם.ת. כללית א ו כל ו ם י ה 0. 340 0. 330 ממוצע 0.300 0.045 ס.ת. צעירים תאים 2$ 0.720 0.630 ממוצע 0. 600 0.080 ם.ת. צעירים תאים 1$ 0.403 0,180 ממוצע 0.300 0.020 ם.ת. * פעילות תםםית מבוטאת ב- pmole/gr Hb

41 סבלה מפי 23: פעילות תסםית, רמת אדנוזין טריפוםפאס וכמות הרסיקולוציסים באנמיה דפדקסורית *** רטיקולוצ ימים ATP 6PGD G6PD PK HK תסס: מה 20 12 10 26 10 26 נסי ונות זקנים vfa תאים 0.4 0. 47 2.9 1.9 2.9 0.13 מםצוע 0.1 0.40 0.8 0.9 0.6 0.09 ם.ת. זקנים 2$ תאים 0.6 0. 64 3.8 2.2 3.8 0.25 ממוצע 0.5 0.20 0.7 0.9 0.9 0.10 ם.ת. כללית א ו כל ו ם יה 3.1 1.10 4.8 3. 6 6.0 0.45 ממוצע 1.0 0.27 1.2 0.4 1.8 0.20 ם.ת. צעירים 2$ תאים 5.0 1.70 7.0 5.0 8.2 0.72 ממוצא 3.8 0.58 2.7 2.1 2.1 0.41 ם.ת. צעירים ifo תאים 10.3 2.80 12.7 10.6 16.1 2.50 ממוצע 3. 8 0.83 4.8 6.2 6.0 0.40 ם.ת. * פעילות תםסית מבוסאת ב- pmole/gr Hb ** כמות ה ATP ניתנת ב Hmole/gr/packed red cells *** ספירת רסיקולוציםים ניתנת ב-$ אנמיה רפרקסורית סידרובלססית בקבוצת חולים עם אנמיה רפרקטורית םידרובלסטית, בניגוד לקבוצות הקודמות, היתה התפלגות האוכלוםיה לפי המסקל הסגולי DDC- דומה לנורמלית (ציור מם 14), ואף הפעילות התםםית באוכלוסיה הכללית קרובה לנורםלית. אולם נמצא מקסע קםן מאד סל תאים קלים יחסית אשר בו היתמ פעילות תםםית גבוהה ביותר (סבלה מס 23). הפעילות התםסית הגבוהה מן המצופה עוררה בנו חשד שמדובר כאן בתאים שלא עברו את כל החלוקות ויאאו למחזור הדם ההיקפי םרם זמנם. מכיון שלרסיקולוציסים